Gap junction channels reconstituted in liposomes show direct evidence for the transfer of the second messengers of cyclic AMP (cAMP) and inositol 1,4,5-trisphosphate ($IP_3$) through the channels. Two types of connexin proteins, Connexin 43 and connexin 32, were purified by using immunoaffinity gel chromatography under nondenaturing conditions from rat brain and liver respectively. It appeared that the purified samples contained both connexin monomers and the hexamers, connexon. The purified connexin 43 and connexin 32 were then reconstituted into artificial unilamella liposomes. The liposomes were applied on the isoosmolar sucrose density gradient and separated into two populations of sucrose-permeable and impermeable liposomes based on the permeability. It was found that the sucrose-permeability was due to the presence of the open gap junction channels in the liposome bilayer and the reconstituted channels appeared to be pH-sensitive and permeable to Lucifer Yellow, a well-known communicating dye molecule. To assess the transfer of second messenger molecules through the channels, the liposomes were formed to entrap the tritium labeled second messengers and the distribution of the second messengers in the gradient was examined. Both cAMP and $IP_3$ were retained only in sucrose-impermeable liposomes which do not contain open channel of connexon while they were leaked out from liposomes containing open channels of Cx43. Liposomes containing open channels of Cx32 also failed to retain the second messengers. These results provide a direct evidence of the transfer of the second messengers through gap junction channels.
간극 연접을 통하여 이차 신호 물질이 통과할 수 있는가를 확인하기 위하여, 간극연접 단백질을 리포좀에 재구성하여 Cyclic AMP (cAMP)와 inositol 1,4,5-trisphospate ($IP_3$)의 투과도를 조사하였다. 쥐 뇌조직에서 발현되는 connexin 43과 간조직에서 발현되는 connexin 32를 각각 항체 친화 크로마토그래피를 사용하여 순수하게 분리하였으며, 분리과정에서의 단백질 변성을 최소화하기 위해 막단백질 용해에 CHAPS와 octylglucoside 같은 비이온성 화합물을 사용하였다. 이렇게 분리된 간극 연접 단백질은 통로구성에 필요한 connexin 6배체의 형태(connexon)를 유지하고 있었으나, 일부 단백질은 단위체로도 존재하고 있었다. 이 순수한 단백질을 사용하여 이중막에 간극 연접 통로를 형성한 리포좀을 성공적으로 재구성했으며, 이 재구성 된 리포좀을 그 통로의 투과도에 따라 분리하였다. Transport-specific density shift assay가 리포좀 분리에 이용되었으며, 이 방법에 따라 리포좀은 수크로스가 투과할 수 있는종류와 투과하지 못하는 종류로 분리되었다. 수크로스가 투과할 수 있는 리포좀은 간극 연접의 통로가 열린 상태로 재구성 된 것으로, 재구성된 이 통로는 산성 환경에서 닫히고 Lucifer Yellow라는 작은 분자량의 형광 물질을 통과시키는 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 특성은 살아있는 동물 세포를 사용한 연구들에서 알려진 간극 연접의 특성과 일치한다. 이렇게 정상적인 기능을 갖도록 재구성된 간극 연접 통로를 통하여 이차 신호 물질이 이동할 수 있는가를 알아보기 위하여, 리포좀 재구성시에 리포좀 내부에 이차 신호 물질을 넣어 준 다음 그 이차 물질이 리포좀 밖으로 빠져 나오는 정도를 조사하였다. 조사 결과 수크로스가 투과하지 못하는 리포좀으로부터는 cAMP와 IP3 같은 이차 신호 물질이 빠져 나오지 못하였고, 열린 간극 연접 통로가 구성되어 수크로스의 투과가 가능한 리포좀만이 이차 신호 물질을 리포좀 밖으로 내보낼 수 있었다. 이러한 결과는 connexin 43을 재구성한 경우와 connexin 32를 재구성한 경우에서 모두 나타났다. 이상의 결과에서 정상적으로 열린 간극 연접 통로를 통하여 cAMP와 $IP_3$ 같은 이차 신호 물질이 통과할 수 있음을 알 수 있었고, 이는 인접한 세포들이 간극 연접을 통하여 이차 신호 물질을 전달하여 서로의 정보를 교환하리라는 가설의 직접적인 증거를 제시하여 준다.
