$P2X_2$ receptor functions as cation-selective ATP-gated ion channel, which is thought to be activated by ATP binding to the extracellular domain of $P2X_2$. We have produced the putative extracellular domain (ECD) of $P2X_2$, in a bacterial expression system. High amount of $P2X_2$-ECD was induced as a form of inclusion bodies by 200μM IPTG at 30℃ for 3 hours at a level of ~100 mg liter^{-1}$ of bacterial culture. The purified $P2X_2$-ECD by immobilized metal affinity chromatography was greater than 95% pure based on Coomassie staining and migrated with the expected mobility of 31 kDa protein. For protein refolding, cysteine sulfhydryl groups were blocked by sulfitolysis reaction and the protein was refolded by the gradual removal of urea. To remove hexahistidine tag, thrombin cleavage of $P2X_2$-ECD was achieved and finally, a single band of the predicted molecular weight of 29 kDa shifted from 31 kDa on Coomassie stained SDS-PAGE.
The functionality of refolded $P2X_2$-ECD was assayed using rapid filtration ATP filter binding. In saturation experiment, the Scatchard plot derived from the data gave a $K_d$ value of 11.3±0.30nM, $B_max$ was $221±0.34pmolmg^{-1}$ protein, and Hill slope was 1.05±0.16. In competition binding studies using antagonists, suramin and cibacron blue inhibited the specific binding of [$3^H$]ATP to $P2X_2$-ECD. Several divalent cations affected the binding of ATP to $P2X_2$-ECD directly. $Ca^{2+}, Mg^2$ and $Zn^{2+}$ at concentrations between 0.1 μM and 10 mM produce a concentration-dependent increase in the binding of [$3^H$]ATP. The magnitude of the increase in binding was the greatest with $ZnCl_2$. But $MnCl_2$ did not affect the binding of [$3^H$]ATP at any concentration we have tested.
In order to demonstrate that ATP directly binds to the refolded $P2X_2$-ECD, we carried out photoaffinity labelling by [$\alpha ^{32}P$]ATP to $P2X_2$-ECD. $P2X_2$-ECD of 29 kDa was specifically labeled by 2 nM of [$α^32P$]ATP. Denatured $P2X_2$-ECD by 8 M urea showed the same level of ATP cross-linking whether the excess amount of unlabeled ATP was present or not, indicating that it was nonspecific ATP crosslinking by UV. On the other hand, the autoradiogram showed a clear decrease of [$α^32P$]ATP crosslinking to the refolded $P2X_2$-ECD in the presence of excess amount of unlabeled ATP. Suramin (1 μM) and cibacron blue (10 μM) also decreased the level of [$α^32P$]ATP crosslinked to $P2X_2$-ECD, whereas the specific binding was enhanced by $Zn^{2+} (100 μM) or $Ca^{2+}$(10 mM) as expected.
We demonstrate that $P2X_2$-ECD forms a stable tetramer in solution by gel filtration chromatography, dynamic light scattering and analytical sedimentation centrifugation. By the chromatogram of sizing chro-matography, the molecular size was estimated to be approximately 160 kDa based on elution times of four molecular weight standards. The molecular weight of $P2X_2$-ECD was also estimated to be ~ 140 kDa by the dynamic light scattering. By equilibrium centrifugation, the molecular weight of $P2X_2$-ECD subunit was measured to be 33 kDa, with the majority of the protein in tetramer (132 kDa). These results indicated $P2X_2$-ECD forms a stable tetramer in solution at a concentration range of 0.1 mg/ml of the protein.
We conclude that the refolded bacterially expressed $P2X_2$-ECD dis-plays ligand-binding and multimerization properties resembling the full-length $P2X_2$ receptor protein. This study provides the first evidence that the extracellular domain of P2X receptors is responsible for nucleotide-binding and is sufficient for submit multimerization. This is also the first in vitro model system with which to study the molecular determinants of nucleotide-binding in this unique family of ATP-binding proteins and may facilitate the development of specific, high affinity P2X receptor anta-gonists.
ATP에 의해서 열리는, 양이온을 선택적으로 통과시키는 channel인 $P2X_2$ 수용체는 $P2X_2$의 extracellular domain에 ATP가 결합함으로써 활성화되는 것으로 생각되어지고 있다. 우리는 박테리아 expression system을 이용하여 예상되는 extracellular domain을 제조하였다. 200 μM 농도의 IPTG를 넣고 30℃에서 3시간동안 수용체 단백질을 발현시켰을 때, 1 liter의 박테리아에서 100 mg 정도의 $P2X_2$-ECD 단백질이 inclusion body의 형태로서 만들어졌다. 금속 친화성 크로마토그라피를 이용하여 95% 이상 순수한 $P2X_2$-ECD 단백질을 정제할 수가 있었으며, 크기는 예상했던 31 kDa이었다. 단백질의 재활성화(refolding)는 sulfitolysis반응을 이용하여 cysteine의 sulfur기를 변형시킨 다음 urea를 제거하는 방법으로 시행하였다. 트롬빈으로 6개의 histidine을 제거했을 때, 단백질의 크기는 31 kDa로부터 29 kDa로 이동하여 최종적으로 예상되었던 29kDa 크기의 $P2X_2$-ECD 단백질을 얻을 수가 있었다.
재활성화된 $P2X_2$-ECD 단백질의 기능은 Whatmann GF/C를 이용한 급속여과법에 의해 $P2X_2$-ECD 단백질에의 ATP결합을 조사하였다. 포화실험으로부터, Kd는 $11.3±0.30 nM$이고 수용체 단백질 mg당 Bmax는 $221±0.34 pmole$로 나타났으며, Hill slope는 1.05±0.16으로 나타났다. 길항제에 의한 ATP결합의 억제를 조사한 결과, suramin과 cibacron-blue 두 길항제 모두 ATP결합을 억제하였다. 몇 개의 2가 양이온들도 $P2X_2$-ECD 단백질에 대한 ATP결합에 영향을 미쳤다. ATP결합이 칼슘이온, 마그네슘이온, 아연이온에 의해서 증가하였는데 이는 이온의 농도에 비례하였다. 아연이온에 의해서 가장 많이 증가하였으며 망간이온은 아무런 증가 효과를 나타내지 않았다.
ATP가 재활성화된 $P2X_2$-ECD 단백질에 직접결합 할 수 있는지를 알아보기 위하여 [$α^32P$]ATP를 사용한 photoaffinity labeling 실험을 수행하였다. 29 kDa의 $P2X_2$-ECD 단백질이 특이적으로 2 nM의 [$α^32P$]-ATP에 의해 표지가 되었다. 8 M의 urea에 의해 denaturation된 $P2X_2$-ECD 단백질은 competitor로 사용한 방사능비표지 ATP유무에 상관없이 동일한 양의 ATP crosslinking이 일어나 이는 비특이적으로 나타났다. 이와 반면에 재활성화된 $P2X_2$-ECD 단백질은 과량의 competitor를 넣었을 경우, [$α^32P$]ATP에 의한 ATP crosslinking이 현저하게 줄어드는 것으로 나타나 ATP에 의한 특이성을 보여준다. 또한, 길항제인 suramin과 cibacron-blue에 의해 억제되었으며, 아연이온과 칼슘이온은 특이한 결합을 증가시켰다.
젤 그름 크로마토그라피, dynamic light scattering, 그리고 analytical sedimentation centrifugation 등의 실험 결과, $P2X_2$-ECD 단백질은 안정한 tetramer를 형성하였다. sizing 크로마토그라피를 했을 때, 표준 크기 단백질과 비교시 160 kDa을 나타내었으며, dynamic light scattering 실험의 결과는 140 kDa으로 평가가 되었다. Equilibrium centrifugation을 시행시 $P2X_2$-ECD 단백질의 크기는 132 kDa로 나타났다. 이상의 결과들로부터 $P2X_2$-ECD 단백질은 0.1 mg/ml 농도의 용액에서 안정한 tetramer를 형성하는 것으로 나타났다.
결론적으로 박테리아에서 발현되어 재활성화된 $P2X_2$-ECD 단백질은 ligand에 결합하고 multimer를 이루는 성질이 $P2X_2$ 수용체 단백질과 유사함을 보였다. 그리고 이 연구는 P2X 수용체의 extracellular domain 만으로 ligand와 결합하고, multimer를 충분하게 이룰 수 있다는 것을 처음으로 증명하였으며, ATP를 ligand로 하는 수용체 단백질군에 있어서 ligand의 결합을 분자수준에서 연구할 수 있는 첫번째의 in vitro model system이며, 특이하고, 높은 친화력을 가지는 P2X 수용체의 길항제 개발에 유용하게 사용될 수가 있다.
