In this study, fermentation strategies for the production of poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA) and insulin-like growth factor I (IGF-I), were developed. PGA is a water-soluble biopolymer and produced as extracellular product by Bacillus licheniformis 9945A. Human insulin like growth factor (IGF-I) is a pharmaceutical protein and produced as intracellular product by recombinant E. coli.
Efficient production of poly(γ-glutamic acid) (PGA) by fed-batch culture of Bacillus licheniformis ATCC 9945A was investigated. In flask culture, PGA production repressed cell growth. When citrate was not added in culture medium, the final cell density were higher due to less production of PGA. In fed-batch culture, PGA production was first suppressed by excluding citrate in the medium. When the cell concentration reached 4.23 g/L, nutrient solution containing citrate was fed, and the final PGA concentration of 34.9 g/L was obtained in 17 hours after feeding. Separation of the growth and production phase by controlling substrate (citrate) in culture medium was successful for enhancing productivity of PGA production.
The effect of induction time and carbon source (glycerol and glucose) on IGF-I production by fed-batch culture of recombinant E. coli was examined. In addition, two feeding strategies, pH-stat and exponential feeding, were compared in fed-batch cultures using glycerol as a carbon source. Glycerol was found to be a better carbon source for IGF-I production in high cell density culture. Induction at lower cell density (mid-exponential phase) was more efficient than induction at higher cell density (late-exponential phase) for fusion IGF-I expression. pH-stat was better than exponential feeding for IGF-I production in fermentations with glycerol as a carbon source. Therefore, an optimal condition for IGF-I production glycerol as a carbon source was to induce at lower cell density or mid-exponential phase using pH-stat as feeding strategy. Under these conditions, 2.8 g/L of fusion IGF-I could be produced.
유가식 배양에 의한 폴리아미노산의 효율적인 생산방법을 확립하였다. Insulin-like growth factor I (IGF-I)은 인체 유용 단백질로 대장균내에 inclusion body 형태로 생산되며, 폴리글루탐산 (γ-PGA)은 수용성 고분자로 Bacillus에 의해 세포외 배지로 생산된다.
Bacillus licheniformis에 의한 폴리글루타믹산(PGA)의 고효율 생산 방법을 확립하였다. 초기배지에서 citrate를 제외함으로써 PGA 생성없이 세포농도를 일정수준 까지 올릴 수 있었고, 그 후 citrate와 L-glutamic acid가 포함된 영양액을 공급함으로써 배양 후 26시간후 (영양분 공급후 17 시간 후)에 34.9 g/L의 PGA를 생산하여 1.34 g PGA/L/h 의 생산성을 보였다. 이는 기존에 보고된 PGA 생산보다 4배 이상 생산성이 높아진 것이다. 따라서 본 연구에서 수행한 바와 같이 일단 PGA 생산을 억제시킨 조건에서 원하는 농도까지 균체를 배양한 후 PGA를 생성 시키는 것이 PGA를 효율적으로 생산하는 좋은 전략으로 생각된다.
재조합 대장균에 의한 IGF-I 생산연구에서는 탄소원과 induction 시기, 그리고 기질공급전략에 따른 IGF-I 생산능을 비교하여 최적 발현조건을 결정하였다. 대장균의 고농도 배양에서 글리세롤이 포도당보다 IGF-I 생산에 적합한 탄소원으로 나타났으며, induction시기는 낮은 세포농도(약 17 g/L)에서 행하였을 때 IGF-I 발현량이 높아졌다. 또한 적합 기질공급전략확립을 위한 exponential feeding과 pH-stat의 비교에서 pH-stat이 글리세롤을 주탄소원으로 이용한 유가식 배양에 의한 IGF-I 생산에 적합한 것으로 나타났다. 따라서 IGF-I생산을 위한 유가식 배양 조건은 글리세롤을 주탄소원으로 하고 낮은 세포농도에서 induction을 수행하며, 기질공급을 pH-stat으로 하였을 때로 결론지어졌다. 이러한 조건에서 2.8 g/L의 융합 IGF-I이 생산되었다.
