Bacteriorhodopsin is a light-sensitive protein in the purple membrane of halobacteria and is currently considered as a promising candidate raw material in the design of molecular electron device and optical computers. The present study of bacteriorhodopsin separation from Halobacterium salinarium SP9 is a part of our continuous effort of bacteriorhodopsin production from bacteria that has been in the Biochemical laboratory of Department of Chemical Engineering.
In the survey of yield and purity among the existing methods, major loss of bacteriorhodopsin was found in the middle step - the condensation of cell membrane fractions by ultracentrifuge. The yield of bacteriorhodopsin in this step was only 50-60%. Though the higher yield (93%) in this middle step was achieved by the simple increase of the rotation and time for centrifuge, this cannot be applied to the large scale separation process. Because ultracentrifuge is required in this step, the scale-up of the process is not feasible and the cost for apparatus is very high.
In order to develop the separation process for bacteriorhodopsin which is efficient and capable of scale-up, several alternative methods - aqueous two phase interfacial condensation, ammonium sulfate precipitation, ultrafiltration - were examined. The final bacteriorhodopsin purification step was performed by gel permeation chromatography.
Several parameters such as molecular weight of polymer, compositions of the system, salt and pH effect were examined to find the optimal condition for the aqueous two phase interfacial condensation. In the compositions of 8% polyethylene glycol 8000, 11% potassium phosphate, pH 7 the yield of bacteriorhodopsin was 90 % and its purity was 8-10%. The total yield after final purification step was about 70%.
In the concentration of 85% saturation of ammnonium sulfate, 97% of bacteriorhodopsin was precipitated. Its purity was 4.7%. The total yield after final purification step was about 73%.
Up to 50,000 of the molecular weight cut off of ultrafiltration membrane, the loss of bacteriorodopsin was not detected in the filtrate. Only 0.5% of bacteriorhodopsin loss was found in the filtrate of 100,000 of molecular weight cutoff of ultrafiltration membrane. The yield was about 99%. The total yield after final purification step was about 75%.
Increased yield of bacteriorhodopsin in the middle step increased the total yield to 70-75%. This is 1.5-2 fold higher than the yield of existing methods (30-50%). Although the purity after the middle step became lower, the final purity of all new methods were above 95%.
본 연구에서는 생물 전자 소자에 응용이 연구되고 있는 광변환 막단백질 Bacteriorhodopsin (BR)을 purple membrane (PM)이라는 생체막의 형태로 사해에서 자라는 halobacteria로부터 효율적으로 분리하는 공정을 개발하고자 하였다.
기존의 BR 분리 방법을 재현하여 각 단계의 수율과 순도를 조사한 결과 세포 파쇄 혼탁액으로부터 초원심분리로 세포막을 회수하는 중간 단계의 수율이 50-60%로 전체 분리 과정에서 가장 큰 손실이 이 단계에서 발생한다는 것을 발견하였다. 따라서 이 단계를 다른 방법으로 대체하여 수율을 증가시켰으며 다음 단계인 BR의 최종 정제는 Gel Permeation Chromatography (GPC)에 의해 정제한 결과 중간 단계의 수율 증가로 인해 전체 분리 과정의 수율이 증가하였으며 모든 대체 방법들에 의한 최종 순도는 95%이상으로 차이가 없었다.
손실이 큰 기존의 중간 단계의 초원심분리 조건을 기존의 50,000×g, 30분에서 120,000×g, 45분으로 증가시켜 수율을 93%까지 증가시켰다. 중간 단계의 수율 증가로 인해서 GPC에 의한 정제를 거친 최종 수율은 기존의 40-50%에서 70%까지 증가하였다. 그러나 이 단계를 위해서는 초원심분리기를 사용하기 때문에 고가의 장치비, 규모 확대의 어려움과 같은 문제가 있었다.
초원심분리에 의한 중간 단계를 대체하여 규모 확대가 가능하며 경제적이고 고수율인 효율적인 공정을 개발하기 위해 수성이상계 계면농축, ammonium sulfate 침전, 한외여과에 의한 방법을 이용하였다.
수성이상계에 의한 방법은 8% Polyethylene Glycol 8000, 11% Potassium Phosphate, pH 7의 조성에서 세포 파쇄 혼탁액을 적용한 결과 90%의 수율, 8-10%의 순도로 BR이 포함된 세포막이 계면에 농축되었다. 이것의 GPC로 정제를 거친 최종 수율은 70%정도로 증가되었다. 침전에 의한 방법은 85% 포화의 ammonium sulfate에 의해서 97%의 세포막이 침전시킬 수 있었다. 이것의 최종 수율은 73%정도였다.
한외여과에 의한 방법은 분자량 배제 한계 50,000까지 여과액에서의 BR의 손실은 전혀 없었다. 99%의 세포막이 농축되었으며 이것의 GPC로 정제를 거친 최종 수율은 75%정도였다.
새로운 농축 방법들에 의해서 최종 수율은 모두 70% 이상으로 증가하였다. 이것으로 1 L의 발효로부터 생산된 약 25 mg의 BR에서 17-19 mg의 BR을 95% 이상의 순도로 얻을 수 있었다. 이것은 기존의 초원심분리를 이용한 방법보다 1.5-2배의 양에 해당하였다.
