Botulinum neurotoxins(BoNT) are the most potent biological toxins which have been known to block the release of neurotransmitter from presynaptic nerve terminal and produce clinical syndromes of rapidly progressive weakness. The toxin is composed of two subunits containing light chain(responsible for Zn-dependent endopeptidase activity)and heavy chain(responsible for binding to its receptor and channel formation). However, the toxins are associated with nontoxic-nonhemagglutinin component (NTNH; about 130kDa) and hemagglutinin components (Hem; about 33 kDa, 17 kDa and 70 kDa), and a series of complexes raging from 220 kDa to 900 kDa of molecular weight are subsequently formed.
Serotype B progenitor toxin gene was cloned and characterized. Nucleotide sequence analysis revealed that the genes for toxin, NTNH, unidentified 22 kDa open reading frame (Orf22), and HEM/33, 17 and 70 were clustered. Northern blot analysis showed that a set of these six genes were organized into three transcription units. Cluster 1 encompasses genes for the toxin and nontoxic-nonhemaggluinin component, forming an operon; the toxin gene can be transcribed alone or co-transcribed with nontoxic-nonhemagglutinin component. Cluster 2 encompasses three genes including Hem33,Hem17,and Hem70 which also form an operon and are transcribed as a tricistronic RNA. The orientation of the three genes was opposite to those of toxin and NTNH gene. The third transcriptional unit existed between NTNH gene and HEM33 gene. The gene encodes Orf22, which is basic protein with 9.0 calculated pI value, presents an helix-turn-helix motif. The primary sequence of Orf22 is turned out to have similarity with a number of many bacterial regulatory proteins such as uvi gene product in Clostridium perfringens and sigma factor in Escherichia coli. These characteristics of Orf22 imply that Orf22 might be a regulatory protein, which controlled the expression of toxin, NTNH and Hem genes. Based on the sequence alignment of the putative promoter regions of Hem33 genes and NTNH genes in C. botulinum subtypes, these regions are highly conserved and considered to be likely an operating motif on which an unidentified transcription factor binds.
For preparation of biologically active recombinant toxin, the structural gene for light chain was inserted to an expression vector pET-3a followed by being expressed in E. coli, and the expressed recombinant protein was purified by chromatography. All the Balb/c mice, which had been immunized with the isolated recombinant light chain, survived at the challenge of up to $10^7$ $LD_50$ purified BoNT/B. The same survival was observed at the challenge of C. botulinum culture supernatant containing the progenitor toxin. These results indicate that the recombinant L chain could be used as a dorminant immunogen. On the other hand, the mRNA of the synaptobrevin II, known as an endogenous target of BoNT/B in the neuronal cell, was amplified as demonstrated by RT-PCR from the mouse brain RNA pool. The gene was further cloned for preparing recombinant synaptobrevin II. Western blotting analysis indicated that the recombinant light chain cleaved both recombinant synaptobrevin II and synaptobrevin II in rat brain synaptosome.
Light chain specific monoclonal antibodies (namely BTBL1, 2 and 3) were prepared. All the antibodies reacted with native BoNT/B as well as recombinant L chain, which have no cross-reactivity with type A botulinum toxin. Interestingly, BTBL3 could also recognize H chain as well as L chain. It was found that BTBL1, 2 and 3 inhibited the cleavage of synaptobrevin II by recombinant light chain, while the H chain specific monoclonal antibody, BTBM4, failed to inhibit the cleavage. Among the monoclonal antibodies, BTBL3 showed the strongest inhibition of synatobrevin cleavage. These results suggest that the epitope of BTBL3 on L chain might play an important role in the function of L chain. Thus,light chain-specific antibodies are suggested as a specific inhibitor of BoNT/B.
보튜리눔 신경독소는 강력한 생물독소로 신경말단으로부터 신경전달물질의 분비를 저해함으로써 치명적인 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이 독소는 아연의존성 단백질 분해효소역할을 담당하는 Light Chain과 신경세포막에 존재하는 수용체와의 결합 및 channel 형성에 관여하는 Heavy Chain으로 이루어져 있다. 이 때 독소는 비독성 비헤마글루티닌 단위체 (NTNH ; 130 kDa)와 헤마글루티닌 단위체 (Hem ; 33 kDa, 17 kDa 그리고 70 kDa)와 같은 비독성단위체와 200 kDa 에서 900 kDa 정도의 복합체를 형성하고 있다.
본 연구에서는 B형 원형 독소 (독소 + 비독소단위체) 유전자들을 클로닝하고 염기서열분석을 통하여 이들 유전자의 구조를 분석하였다. 그 결과 독소, NTNH, 알려져 있지 않은 22 kDa ORF (Orf22) 그리고 Hem 유전자들이 cluster를 형성하고 있음을 알 수 있었다. Northern Blot 분석결과 이들 여섯 가지의 유전자들을 세가지 transcriptional unit으로 구성되어져 있는 것을 알 수 있었다. 독소와 NTNH 유전자가 첫번째 cluster를 이루면서 오페론을 형성하고 있다. 독소 유전자는 NTNH 유전자와 함께 전사되기도 하며 단독으로도 전사되고 있다. Hem 유전자들이 두 번째 cluster를 이루는데 역시 오페론을 형성하며 그 ORF의 방향은 첫번째 cluster와는 반대방향이었고, 모든 Hem 유전자들이 하나의 transcriptional unit으로 전사되고 있다. 세 번째 transcriptional unit인 Orf22는 NTNH 유전자와 Hem33 유전자 사이에 존재하고 있다. 이 Orf22는 pI값이 9.0으로 염기성 단백질이며 Helix-Turn-Helix motif를 가지고 있다. 더욱이 Clostridium perfringens의 uvi 유전자산물이나 Escherichia coli의 sigma factor와 같은 조절 단백질과 이마노산서열상에서 많은 유사성이 존재하는 것으로 보아 독소, NINH 그리고 Hem유전자들의 발현을 조절하는 단백질로 추측되어 진다. 다른 C. botulinum에서 발견되는 NTNH와 Hem33유전자 사이의 잠정적인 프로모터 부위와 본 연구에서 밝혀진 상응하는 부위와의 염기서열 비교분석 결과, 강력하게 보존되어진 부위가 나타나고 있는 것으로 보아 이 부위가 operating motif일 가능성을 시사하여 준다.
한편, 생물학적 활성을 지닌 재조합 독소를 만들기 위해 Light Chain유전자를 대장균 발현벡터인 pET-3a에 서브클로닝하고 이로부터 재조합 단백질을 생산, 분리하였다. 재조합단백질을 Balb/c마우스에 면역시킨 후 $10^7$ $LD_50$ 농도까지의 독소를 투여하여도 모든 마우스가 생존하였다. 면역시킨 마우스에 원형독소가 포함된 C. botulinum 배양액을 투여하여도 역시 생존함을 알 수 있었다. 이러한 결과로서 재조합 Light Chain이 백신으로 충분히 기능을 하고 있음을 제시한다. 이와 더불어 독소의 기질로 알려진 Synaptobrevin을 랫트의 뇌로부터 분리하고 또한 재조합 단백질로도 제조하여 재조합 독소와 반응시켰을 때 모두 잘 분해되어짐으로 보아 재조합 독소가 생물학적 활성을 가지는 단백질임을 시사한다.
마지막으로 Light Chain 특이적 단일클론항체들을 제조하고 이들의 특성을 규명하였다. BTBL1, 2, 3라는 세가지 종류의 항체를 스크리닝하였다. 항체 모두가 재조합 Light Chain은 물론 Native독소까지 잘 인지하였고 type A 독소와는 교차반응을 보이지 않았다. BTBL3의 경우 Light Chain뿐만 아니라 Heavy Chain과도 교차반응을 보였다. 세 항체는 재조합 Light Chain의 Synaptobrevin분해 반응을 방해하는 특성을 보이는 반면, Heavy Chain 특이성 항체의 경우 분해반응을 방해하지 못하였다. 이 때 BTBL3가 가장 강한 방해 양상을 보였는데 이는 BTBL3의 epitope가 Light Chain의 기능에 중요함을 시사하여준다. 이러한 Light Chain 특이적 항체들은 보튜리눔 독소의 inhibitor로서 응용될 수 있음을 제시한다.
