A yeast, Hansenula polymorpha is one of the promising hosts for the production of recombinant proteins due to the availability of powerful promoters and the possibility of multiple integration of a transforming DNA. To develop a multiple gene integration system in H. polymorpha strain DL-1, several autonomously replicating sequences of Hansenula(HARSs) with the characteristics of tandem integration were cloned by an enrichment procedure and characterized for their functional elements. All plasmids harboring newly cloned HARSs showed a high frequency of transformation and integration into the chromosome after stabilization. HARS36 was selected for its high efficiency of transformation and tendency of integration. Several tandemly repeated copies of the transforming plasmid containing HARS36 integrated into the vicinity of the chromosomal end.
Three functional domains of HARS36, A, B and C, required for its HARS activity were analyzed by deletion analyses. Domain A contained AT-rich ARS core sequences. Domain B contained two directly repeated sequences, RS-I and RS-II which were predicted to form a bent DNA structure. Deletion of the AT-rich core in domain A resulted in a complete loss of ARS activity, and deletion of the bent region in domain B greatly reduced the stability of the transforming plasmid. Domain C included 18 identical repetitions of the direct repeat sequence(5'-GGGTGGCG-3') which is required for the facilitated chromosomal integration of transforming plasmids.
The chromosomal origin of HARS36 was found to be an end of a chromosome which contains a telomeric ARS(domains A and B) and telomeric repeated sequence(domain C). Genomic Southern blotting with a telomeric fragment of HARS36 as a probe showed several homologues in the genome which were sensitive to endonuclease Bal31. It indicated that HARS36 is a member of multiple ARSs, which are located near several telomeres of different chromosomes (HARS36 type). Several telomeres, if not all, were found to be very similar to the telomere from which HARS36 originated. Nucleotide sequences of the three newly cloned telomeric fragments were nearly identical to that of HARS36 with one exception in which a large deletion was identified. The chromosomes ended with several conserved elements and 18-23 identical repetitions of 5'-GGGTGGCG-3',running from the centromere towards the termini.
A multiple gene targeting system to the telomere in a tandemly repeated arrangement was developed using a bacterial aminoglycoside 3-phospho- transferase (APH) gene of Tn903 to confer resistance to antibiotic G418. The unmodified APH gene expression cassette of Tn903 failed to be used for a dominant selection marker due to the unacceptably weak expression of G418 resistance gene, resulting in the selection of spontaneous resistance mutants. For the proper performance of APH gene as a dominant selection marker in this yeast, a constitutive promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was obtained and fused to the open reading frame of the bacterial APH gene. The fusion construct conferred the resistance to G418 sufficient for the rapid growth of the transformants in the medium containing 4 mg/mL of G418, thus eliminating the selection of spontaneous resistant cells. The fused expression cassette facilitated the selection of integrants with up to 15 copies of transforming plasmids which were targeted to the end of the chromosome in a tandemly repeated arrangement. To increase the integration copy number by extension of the linear dose- response range, the GAPDH promoter was deleted up to the -61 nt. With this weak expression cassette of APH gene, the integration copy number of a transforming plasmid could easily be controlled between 1 to 50 by the use of plate medium containing different concentrations of G418 in a range of 0 to 4 mg/mL.
Hansenula polymorpha DL-1을 이용한 재조합 단백질 생산 시스템을 개발하기 위하여 외래유전자를 동 균주의 염색체내로 다중병렬형으로 도입할 수 있는 특정 자기복제서열(HARS)을 클로닝하고 그 특성을 분석하였다. 클로닝된 5가지의 새로운 자기복제서열을 갖는 플라스미드들은 형질전환후 세포내에서 자기복제됨을 확인하였고 안정화과정을 거친후에는 염색체내로 삽입됨을 확인하였다. 이들 중 형질전환효율 및 유전자 삽입능이 우수한 HARS36을 선별하여 유전자삽입 형태 및 위치를 조사한 바 형질전환된 플라스미드가 염색체의 말단에 다중병렬형으로 삽입됨을 확인하였다.
외래유전자를 염색체의 말단에 다중병렬형으로 삽입하는 HARS36의 특성을 분석하기 위하여 유전자 deletion 및 염기서열분석을 통하여 HARS36에는 3개의 기능성 인자 (functional element), A, B 및 C가 존재하고 있음을 확인하였다. 인자 A는 자기복제활성에서 가장 중요한 ARS core 서열로서 AT-rich 서열로 구성되어 있으며 인자 B는 곡선형 구조를 유발하는 두개의 direct repeat 서열, RS-I 및 RS-II로 구성되어 있다. 인자 A가 결실되면 자기복제능을 완전히 소실하였고 인자 B가 결실된 경우에는 자기복제활성이 상당히 감소하여 세포의 성장속도가 매우 저조하였다. 인자 C는 특이하게 direct repeat 서열(5‘-GGGTGGCG-3’)이 18번 반복되는 서열로 구성된 부분이며 이는 형질전환된 외래유전자를 염색체내로 용이하게 도입하는 특징을 보였다. 인자 C가 제거된 경우에는 외래유전자의 염색체도입효율 및 도입 copy수가 감소되었다.
HARS36의 염색체 기원을 조사한 바 HARS36은 염색체의 말단, 즉 말단소자 (telomere)에서 유래하였음을 확인하였고, 이는 염색체 말단에 존재하는 자기복제서열(인자 A 및 B)과 말단반복서열(telomeric repeated sequence) (인자 C)로 구성되어 있음을 확인하였다. HARS36을 표지로 이용한 Southern blot에서 염색체내에는 HARS36과 유사한 서열이 다수 존재하고 있음을 알 수 있었고, 이들 모두는 exonuclease Bal31에 매우 민감하기 때문에 염색체 말단에 존재하는 서열임을 확인할 수 있었다. 새로이 클로닝한 3개의 염색체말단의 유전자 염기서열이 HARS36과 거의 일치하기 때문에 HARS36은 모든 염색체의 말단에 존재하지는 않으나 적어도 4-5개의 염색체 말단에 존재하는 다중 자기복제서열임을 확인하였다. HARS36 형태(HARS36 type)의 염색체 말단은 몇가지의 conserved element와 말단반복서열(5‘-GGGTGGCG-3’)이 18-23번 반복된 서열로 구성되어 있음을 확인하였다. 몇가지 다른 효모에서의 말단 유전자 상동성을 Southern blot을 통하여 조사한 바 동일한종에서도 상당한 변이가 관찰되었다.
HARS36을 이용하여 외래유전자를 도입할때 용이하게 다중으로 도입된 형질전환주를 선별하기 위하여 대장균의 transposon(Tn903)유래의 kanamycin 저항성을 유발하는 aminoglycoside 3-phosphotransferase(APH) 유전자를 이용하는 선별방법을 개발하였다. APH유전자의 발현을 Tn903 유래의 자체 promoter를 사용하여 선별할 경우 G418을 함유한 배지에서 세포의 성장이 매우 느렸고 Southern blot을 통하여 도입된 유전자수를 조사한 결과에 의하면 도입된 유전자의 수와 관계없이 G418을 함유한 배지에서 자발적인 변이를 통해 비특이적인 저항성을 보임을 알 수 있었다. 이는 대장균 유래의 promoter가 H. polymorpha에서 정상적으로 작동하지 못하기 때문으로 판단되었다. 대장균 유래의 APH 유전자를 동 균주에서 정상적인 선택표지로 사용하기 위해서는 동 균주 유래의 발현 promoter가 요구됨으로 동 균주 유래의 구조적 발현 promoter를 확보하기 위하여 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자를 Saccharomyces cerevisiae의 GAPDH유전자를 표지로 이용하여 클로닝하였고 그 특성을 분석하였다. GAPDH promoter와 APH유전자를 연결한 발현 cassette를 이용하여 형질전환하였을 때 4mg/mL의 G418배지에서도 빠른 성장을 보였으며 G418농도별로 선별된 형질전환주에서 도입된 유전자수를 조사한 결과에 의하면 G418농도 2mg/mL까지 도입 유전자수가 증가하여 약 15 copy정도가 염색체 말단에 다중 병렬형으로 도입되었음을 알 수 있었다. 그러나 그 이상의 G418농도에서는 도입 유전자수에 관계없이 세포가 성장하였는데 이는 발현 promoter가 강력하기 때문으로 판단되어 promoter deletion을 통하여 G418농도와 도입 유전자 수와의 비례 관계 범위를 확대시켰다. 결과적으로 GAPDH promoter를 -61까지 deletion한 GAP61 promoter에 결합된 APH 유전자 발현 cassette를 이용하였을 때 G418 농도 조절을 통하여 도입 유전자수를 1에서 50 copy 까지 인위적으로 조절하여 선별할 수 있었다.
