Signal transduction pathways are the attractive targets for the discovery of anticancer agents because the investigations can focus on the sites of the fundamental impediment leading to uncontrolled cell growth. Phosphatidylinositol(PI) turnover is a major mechanism of signal transduction in mammalian cells and is considered to be implicated in the regulation of cell proliferation.
So, inhibitors of PDGF-induced PI turnover in fibroblast NIH 3T3γ1 cell were screened from metabolites of actinomycetes. As a result, isolate MT 1882-5 was selected as the producer of an inhibitor because of its strong and reproducible inhibitory activity. To identify the isolate, the morphological characteristics, the analysis of components in cell wall hydrolysate, and the electron microscopic observation were examined. The color of mature aerial mycelium was in the gray series and spore morphology was round, spiny and spiral. The compositions of diaminopimelic acid(DAP) isomers and amino acids in cell wall hydrolysate were LL-DAP, alanine, glutamic acid and glycine. Therefore the strain was identified as Streptomyces sp. and designated Streptomyces sp. MT 1882-5.
An inhibitor of PI turnover from a culture broth of Streptomyces sp. MT 1882-5 was purified as yellowish amorphous powder through ethylacetate extraction and several chromatographic methods such as Amberlite XAD-2, silica gel, Sephadex LH-20 and Lobar RP-18 column chromatography, and designated MT 1882-Ⅱ. From the spectroscopic data of UV, NMR and FAB mass, the purified inhibitor, MT 1882-Ⅱ, was identified as glucopiericidin A which substituted a glucose moiety in the C-10 position of piericidin A1.
MT 1882-Ⅱ inhibited PDGF-induced PI turnover in NIH 3T3γ1 cell with an IC50 value, 5㎍/㎖, but did not inhibit EGF-induced PI turnover in A431 cell. It did not inhibit in vitro phospholipase Cγ1 (PLCγ1) activity involved in PI turnover. Inhibition of MT 1882-Ⅱ on PDGF-induced PI turnover in NIH 3T3γ1 cell results from reducing the in vivo tyrosine kinase activity of PDGF receptor, which is necessary for the PDGF-induced activation of PLCγ1, though the compound did not inhibit in vitro PDGF receptor tyrosine kinase.
MT 1882-Ⅱ showed no inhibitory activity on in vitro protein kinase C (PKC) but inhibited the bleb-formation of K562 cell induced by phorbol-12, 13-dibutyrate (PDBu),which is correlated with the activation of PKC. MT 1882-Ⅱ did not induce the morphological reversion of temperature sensitive src-transfected normal rat kidney (ts/NRK) cell, which viral src oncogene product converts to the transformed phenotype of the cell at 32℃ and did not inhibit the IL-2 production in EL4/IL2 cell stimulated with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and Jurkat cell done with CD3 antibody.
MT 1882-Ⅱ showed the strongest cytotoxic activity on M-14 (melanoma cancer cell) and PC-3 (prostate cancer cell) and the concentration of 50% growth inhibition (GI50) values of those were about 0.05㎍/㎖ and 0.06㎍/㎖, respectively. But it did not inhibit the growth of NCI-H23 (lung cancer cell), SNB-19 (central nervous system) or SF-539 (central nervous system). The cytotoxicity of MT 1882-Ⅱ on some cancer cell lines results from the inhibition of PI turnover in the cells.
무절제한 세포증식을 가능케 하는 어떤 특정 부분의 신호 전달과정을 조절함으로써 기존 항암제와 작용기작이 다른 새로운 항암제를 개발할 가능성이 매우 높다. 그러한 세포내 신호전달 과정 중에서 phosphatidylinositol 순환은 동물세포에서 중요한 역할을 하며 세포의 증식을 조절하는데 관여하는 것으로 알려졌다.
혈소판유래성장인자에 의해 유도되는 NIH 3T3γ1 세포의 phosphatidylinositol 순환에 대한 저해물질을 탐색하기 위하여 토양방선균을 대상으로 1차 탐색한 결과, 저해활성이 매우 높고 재현성이 있는 방선균분리 주 MT 1882-5를 선정하였다. 방선균분리주 MT 1882-5를 동정하기 위하여 분리주의 형태학적 특성,세포벽 가수분해물의 diaminopimelic acid (DAP) 조성 및 아미노산 조성과 전자 현미경상에서의 포자 형태 등을 조사한 결과, Streptomyces 속에 속하는 것으로 확인되어 Streptomyces MT 1882-5로 명명 하였다.
이 균주로 부터 phosphatidylinositol 순환 저해물질을 생산하기 위하여 ℓ당 포도당 10g, 가용성 전분 20g, 대두박 25g, 효모 추출물 4g, $KH_2PO_4$ 0.005g 이 들어 있는 14ℓ 발효기에서 5일간 배양하였다. 배양액으로 부터 Amberlite XAD-2 수지 흡착, ethylacetate 용매 추출, silica gel column, Sephadex LH-20 column과 low pressure RP-18 column chromatography를 통하여 노란 분말의 저해물질을 얻어 MT 1882-Ⅱ로 명명하였다. 저해물질의 구조를 동정하기 위하여 UV, NMR, FAB mass 등과 같은 기기 분석을 실시한 결과,저해물질 MT 1882-II는 구조내에 1 분자의 포도당이 β 결합하고 있는 glucopiericidin A로 동정되었다.
MT 1882-Ⅱ는 혈소판유래성장인자에 의해 유도되는 NIH 3T3γ1 세포의 phosphatidylinositol 순환에 대한 저해활성을 보였으나 (IC50=5㎍/㎖),phosphatidylinositol 순환에 직접적으로 관련이 있는 phospholipase Cγ1(PLCγ1)효소활성에 대한 저해활성은 전혀 없었다. 따라서 이러한 저해활성은 PLCγ1을 활성화하는 혈소판유래성장인자 수용체의 protein tyrosinekinase활성이 저해되어 궁극적으로 phosphatidylinositol 순환 활성이 저해된 것으로 추정된다.
또한 혈소판유래성장인자와 유사한 신호전달과정을 거치는 것으로 알려진 상피세포 성장인자에 의해 유도되는 A431 세포내의 phosphatidylinositol 순환에 대한 영향을 확인한 결과, 저해활성이 없었다. 따라서 저해물질 MT 1882-Ⅱ는 상피세포 성장인자보다 혈소판유래성장인자에 의해 유도되는 세포내 신호전달과정에 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
MT 1882-Ⅱ의 phosphatidylinositol 순환에 대한 저해활성이 다른 세포반응에 어떤 영향을 미치는지를 알아 본 결과, 세포내 신호전달 과정에서 중요한 역할을 하는 protein kinase C(PKC)에 대한 저해활성은 없었으나 PKC를 활성화하는 phorbol-12,13-dibutyrate (PDBu)에 의해 유도되는 K562 세포의 소포형성에 대한 저해활성을 보였다. 이 결과는 MT 1882-Ⅱ가 세포내 phosphatidylinositol 순환을 저해하여 PKC 효소활성에 필요한 $Ca^++$ 공급을 차단하여 K562 세포의 소포형성이 저해된것으로 추정된다. Src 발암유전자에 의해 transformed phenotype으로 형태 변환을 하는 ts/NRK에 대한 MT 1882-Ⅱ의 영향을 조사한 결과, transformed phenotype에서 정상세포 형태로의 전환활성이 없었다. 이 결과를 통해 MT 1882-Ⅱ는 src 발암유전자의 발현산물에 대한 저해활성은 없는 것으로 확인되었다. 또한 phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) 와 CD3 항체에 의해 세포내 phosphatidylinositol 순환이 활성화되어 최종적으로 IL-2 생산이 유도되는 EL4/IL2 와 Jurkat 세포에서의 IL-2 생산을 저해하지 않았다.
MT 1882-Ⅱ는 M-14 (melanoma cancer cell, GI50=0.05㎍/㎖)와 PC-3 (prostate cancer cell, GI50=0.06㎍/㎖) 등의 암세포주의 성장을 저해하였으나 NCI-H23 (lung cancer cell), SNB-19 (central nervous system)와 SF-539 (central nervous system)의 성장에 대한 저해활성은 없는 것으로 나타났다. 암세포에 대한 세포독성은 세포의 성장에 중요한 세포내의 phosphatidylinositol 순환이 저해되어 나타난 것으로 추정된다.
