SecA protein of Escherichia coli (E. coli), an ATPase essential for the translocation of precursor proteins, was found to have an additional activity of RNA helicase. This RNA unwinding activity of SecA was tested with two kinds of RNA duplex which have different predicted stability and nucleotide sequence. Each of these duplexes is consisted of two strands of unequal length with single-stranded ends. The RNA helicase activity of SecA required ATP and divalent cations. A monovalent cation such as K+ was ineffective for this activity. The helicase activities of NS3 protein of hepatitis C virus(HCV) and its deletion mutant were compared with that of SecA under the same condition. A clear confirmation of this SecA RNA helicase activity came from the inhibition of unwinding of the RNA duplex when SecA was preincubated with its own polyclonal antibody. The preimmune IgG could not inhibit the RNA unwinding by SecA.
Next, the RNA binding and the ATPase activity of SecA were studied. For this study, several different single and double strand RNAs were used. It was observed that the SecA protein binds to RNA regardless of its duplexity and nucleotide sequence. This nonspecificity of SecA protein for the RNA substrate was also observed in a previous result that SecA could unwind two kinds of RNA duplex. The ATPase activity of SecA was stimulated by the binding of RNA to the SecA protein. The effect of divalent cation concentration on the ATPase activity was the same as that on the RNA helicase activity of SecA.
Finally, the effect of precursor ribose binding protein (pRBP) on the RNA binding and the ATPase activity of SecA were studied. First, it was observed that the RNA binding efficiency of free SecA protein was greater than that of pRBP-bound SecA protein. Second, the extent of ATP hydrolysis by SecA increases when preincubated with RNA, but decreases when the refolding pRBP was added to the RNA-bound SecA protein.
Possible biological function of the SecA RNA helicase activity is discussed.
대장균에 존재하는 SecA 단백질은 분비 단백질의 세모막 통과에 필수적인 ATP 가수분해 효소인데, RNA helicase 라는 새로운 활성이 발견되었다. 예측된 2차 구조의 안정성과 염기 서열이 서로 다른 두 가지 종류의 이중 가닥 RNA를 가지고 SecA 단백질의 이 새로운 기능을 테스트하였다. 이 RNA 기질은 이중 가닥의 양 끝이 모두 구성 단일 가닥으로 노출되어 있는 공통점을 가지고 있다. SecA의 RNA helicase 활성에는 ATP와 2가의 양이온이 필요하며, 이 활성은 그들의 농도에 의존적임을 알았다. SecA가 이중 가닥의 RNA를 단일 가닥으로 푸는 활성에 있어서 1가의 양이온 (KC1)은 마그네숨이나 망간과 같은 2가의 양이온을 대신할 수 없었다. 기존에 알려져 있던 RNA helicase인 NS3 단백질과 그 활성을 잃은 하나의 돌연변이 단백질을 이용하여, 동일한 조건에서 SecA 단백질의 RNA helicase 활성을 확인하였다. SecA가 진정으로 RNA helicase라는 새로운 활성을 갖는다는 것은 SecA에 특이적인 항체에 의하여 그 활성이 저해됨을 관찰함으로써 더욱 확실해 졌다. 반면, SecA에 특이적인 면역반응을 겪기 전의 토끼의 혈청에서 정제한 IgG는 위와 같은 저해 효과를 나타내지 못했다.
SecA의 새로운 활성이 막을 경유한 단백질 수송과 어떠한 관계에 있는가를 알아보기 위하여, RBP 전구체 단백질 (pRBP)이 SecA의 RNA 결합 및 ATP 가수분해 활성에 어떠한 영향을 미치는지 관찰하였다. 이 연구를 수행하기 위하여 여러 가지 종류의 RNA 기질을 고안, 준비하였다. 우선, 2가의 양이온 및 ATP의 농도, 반응물의 pH 등이 SecA의 ATP 가수분해 활성에 미치는 영향이 SecA의 RNA helicase 활성에 미치는 영향과 부합됨을 관찰했다. 또한 RNA가 결합된 SecA의 ATP 가수분해 활성은 RNA가 존재하지 않는 자유로운 SecA보다 증가된 양상을 보였다. 이러한 결과들은 SecA의 ATP 가수분해 활성이 RNA helicase 활성을 반영하고 있음을 보여준는 것이다. 그 밖의 ATP 가수분해 활성의 특성으로서, 효소의 활성을 SecA 및 ATP의 농도에 비례하였고, 낮은 pH에서의 활성이 높은 pH에서의 활성보다 우수하였으며, 이러한 pH의 효과는 SecA의 농도가 높을수록 크게 나타났다. 한편, SecA가 이중 가닥의 RNA 및 이를 구성하는 단일 가닥의 RNA에도 결합하며, 효모에서 추출한 과량의 tRNA에 의하여 RNA 기질의 결합이 방해 받으며, RNA 기질의 염기 서열에 관계없이 SecA가 결합할 수 있는 것으로 보아, SecA와 RNA의 결합은 비특이적인 것으로 판단된다. 본론으로 들어가,pRBP가 결합되어 있는 SecA는 RNA에의 결합력이 약화되었으며, ATP 가수분해 활성도 SecA에 대한 pRBP의 양이 증가함에 따라 점점 감소하는 양상을 나타내었다. 또한, 일단 RNA에 결합하여 ATP 가수분해 활성이 증가한 SecA일지라도 pRBP의 첨가에 의하여 다시 활성이 떨어지게 됨을 관찰하였다.
