M1 RNA is the RNA component of Escherichia coli RNase P, a tRNA-processing enzyme. When the rnpB gene encoding M1 RNA is transcribed, the primary M1 RNA transcript of 413 nucleotides (pM1 RNA) is produced and subsequently processed at the 3' end to generate the mature M1 RNA of 377 nucleotides. However, the mechanism of the processing is relatively unexplored. The first aim of my study is to investigate features of pM1 RNA thought to be involved in the 3' processing of M1 RNA. To examine the requirement of the M1 RNA sequence in the primary transcript for the processing reaction, first, I constructed plasmids containing the rnpB gene with a series of internal deletions in the M1 RNA sequence. The deletion plasmids containing at least both 56 nucleotides at the 5' and 14 nucleotides at the 3' in the M1 RNA sequence generated truncated transcripts processed normally at the 3' end, suggesting that the intact M1 RNA sequence is not required for the 3' processing. To study features of pM1 RNA thought to be involved in M1 RNA processing at 3' end, the systematic mutations were introduced in sequence elements and secondary structures surrounding the processing site using p23 RNA, a truncated pM1 RNA transcribed from the internally deleted rnpB gene, as a model substrate. The processing of its mutant derivatives was analyzed in vivo and in vitro. Neither the alteration of two bases forming the processing site nor the disruption of secondary structures surrounding the site significantly affected the processing efficiency although the secondary structures were required for maintaining RNA stability. In contrast, the mutations at the rne-dependent site, GAUUU, immediately 3' to the processing site inhibited the processing and the extent of the inhibition varied with the altered sequences. Although there is no simple relationship between the changes in the rne-dependent site and the inhibition of the processing, U nucleotides in the mutated sequences are preferred for efficient processing. Furthermore, the processing of the mutants of the rne-dependent site as well as wild type p23 RNA was inhibited in an E.coli rnets strain at the nonpermissive temperature.
The second aim is to analyze the function of the repeated sequences in the 3' flanking region of the rnpB gene on RNA processing as well as transcription termination. It has been known that the 3' flanking region of the rnpB gene contains a 113 bp repeated sequence, successively reiterating 3.5 times, each of which includes the region for intrinsic termination and rne-dependent pentanucleotide sequence. In vivo termination of transcription occurs mostly at the first terminator (T1). Analysis of deletions at the 3' flanking region revealed that the second terminator (T2) and the third (T3) are functional in vivo and that the sequences preceding the coding region for an RNA-terminator hairpin and U- rich 3' tail are essential for efficient termination. Transcripts terminating at T2 and T3 were also processed at the 3' end in a manner similar to those terminating at T1, suggesting that the rne-dependent sites in the second and third repeats are functional and the 3' processing is tolerant of one nucleotide variation in the pentanucleotide. Another deletion analysis, where deletions were extended from T3 into T1, showed that the region encoding the RNA-termination hairpin alone without the U-rich 3' tail can function as a terminator in vivo and the processing event is independent of termination site if the transcripts contain the rne-dependent site.
The third aim is to assess the pathways involved in 3' processing of M1 RNA. For this assessment, in vitro 3' processing reaction was analyzed using wild-type and rne-dependent site mutants p23 RNAs as model substrates. In an in vitro 3' processing reaction of p23 RNA using a 40% ammonium sulfate precipitate of S30 fraction (ASP-40), the formation of intermediate products having the 3' end of +386 (major) and +385 (minor) was detected. The intermediate RNA with 3' end of +386 made in vitro was processed to final products. These results suggest that 3' processing of M1 RNA occurs by a pathway involving intermediate (pathway I) while there is an alternative pathway (pathway II) which does not involve intermediates. The position of 3' end of the precursor molecules determined the choice of the pathways. The precursor having the 3' end of position +413 was processed by both pathways while that of position +415 was processed by pathway II. ASP-40 fraction generated final processing products containing one or two more nucleotides at the 3' end, regardless of which pathway was used. Both formation of the intermediate and its conversion to the final product in pathway I are rne-independent. In contrast, the formation of final products from p23 RNA by pathway II is rne-dependent. In vitro processing of rne-dependent site mutant p23 RNAs was also performed: processing efficiencies in vitro were relatively consistent with those in vivo. The choice of processing pathways and 3' end of final processing products are dependent of mutated sequences. Detailed analysis of cleavage positions implies the presence of a relationship between processing activities and cleavage sites.
M1 RNA는 tRNA의 5' 말단을 성숙시키는 대장균 RNase P의 RNA성분이다. M1 RNA를 코드하는 rnpB 유전자가 전사되면 413 누클레오티드의 일차전사체 M1 RNA (pM1 RNA)가 만들어지고 3' 말단에서 가공과정이 일어남으로써 377 누클레오티드의 성숙된 M1 RNA가 형성된다. 그러나, 가공과정의 메카니즘은 거의 알려져 있지 않다. 첫째, M1 RNA의 3' 가공과정에 관여하는 일차전사체 M1 RNA내의 요소들을 조사하고자 하였다. 먼저, 가공반응이 일어나기 위해 완전한 M1 RNA 염기서열이 필요한가 알아보기 위해 M1 RNA 염기서열이 내부에서 순차적으로 결실된 rnpB 유전자를 가진 플라스미드들을 제조하였다. 최소한 5' 영역에 56 누클레오티드와 3' 영역에 14 누클레오티드를 가지면 정상적인 가공반응이 일어났으며 이 결과는 3' 가공과정에 완전한 M1 RNA 염기서열이 필요하지 않음을 의미한다. 3' 가공과정에 영향을 미치는, RNA 내의 요소들을 결정하기 위해 절단위치를 둘러싸고 있는 이차구조 및 단일가닥 영역을 체계적으로 변화시킨 돌연변이화 실험을 수행하였다. 내부가 결실된 rnpB 유전자중 하나를 선택하여서 그 일차전사체를 p23 RNA라고 명명하였고 모델기질로서 사용하였다. 돌연변이체들의 가공반응을 생체내와 시험관내에서 조사한 결과, 가공위치를 형성하는 두 염기서열이 변화하거나 가공위치를 둘러싼 이차구조들을 파괴하여도 가공반응의 효율은 크게 변화하지 않았다. 단, 이차구조들은 RNA 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 하였다. 이에 비하여 절단위치의 3'에 밀접하여 있는 rne 의존자리의 5 누클레오티드의 염기서열(GAUUU)을 변화시키면 가공반응이 저해되었고 변화된 염기서열에 따라 저해정도가 다르게 나타냈다. 가공반응의 저해정도에 따라서, rne 의존자리 염기서열이 consensus 하게 나타나지 않았지만 U 누클레오티드가 많이 존재할수록 가공반응의 효율성이 높은 것으로 나타났다. 또한 $rne^ts$ 균주내 야생형 p23 RNA 및 rne 의존영역의 염기서열이 변화된 돌연변이들은 비허용온도에서 가공반응이 거의 진행되지 않는 것으로 나타났다.
둘째, rnpB 유전자의 3' 인접 영역에 존재하는 반복 염기서열들이 전사종결 및 RNA 가공과정과 관련하여 어떤 기능을 담당하는가를 조사하였다. 이 3' 인접 영역은 113 bp 의 염기서열이 약 3.5 회 반복되며 각각 이 영역들은 전사종결을 위한 영역과 rne 의존자리를 포함하고 있다. 3' 인접 영역을 결실시킨 결과 두번째 전사종결제 (T2)와 세번째 전사종결제 (T3)가 첫번째 전사종결제 (T1)와 마찬가지로 생체내에서 기능을 할 수 있으며 또한 효율적인 전사종결이 일어나기 위해서, RNA-terminator hairpin 및 U-rich 3' tail의 앞쪽에 존재하는 일부의 염기서열이 필요한 것으로 나타났다. T2와 T3에서 종결된 일차전사체들도 정상적인 가공반응이 진행되었으며 이 결과는, 첫번째 반복단위에 존재하는 rne 의존자리와 1 누클레오티드씩 다른 염기서열을 가지는, 두번째와 세번째 단위에 존재하는 rne 의존자리도 똑같이 인식되어 절단됨을 의미한다. T3 에서 T1의 방향으로 3' 인접영역을 결실시킨 실험결과, U-rich 3' tail 영역없이 RNA-terminator hairpin만으로도 생체내에서 전사종결이 가능한 것으로 나타났다. 그리고 가공반응은 전사종결위치와 상관없이 rne 의존자리에 의해 결정되었다.
셋째, M1 RNA의 3' 가공과정의 경로를 조사하였다. 이를 위하여 야생형 및 rne 의존자리 돌연변이체 p23 RNA들의, S30분획의 40% ammonium sulfate 침전물 (ASP-40)을 이용한 시험관내 3' 가공반응을 수행하였다. p23 RNA의 가공반응에서 3' 말단이 +386 과 +385인 중간체 RNA의 생성이 관찰되었th?. 그리고 시험관내에서 전사시켜 얻은 +386 중간체 RNA는 시험관내 가공반응에서 가공되어 최종 생성물로 변환되었다. 이 결과들은 M1 RNA의 3' 가공반응이 중간체를 거치는 경로 (경로 I)에 의해서 일어남을 의미하였고 또한 중간체를 거치지 않는 다른 경로 (경로 II)도 존재하였다. 전구체 RNA의 3' 말단의 2 누클레오티드의 길이차이에 의해 가공과정 경로가 선택되었다: 3' 말단이 +413인 전구체 RNA는 두 경로 모두에 의해 가공되고 +415인 전구체는 경로 II에 의해서만 가공되었다. 경로 I의 두 단계는 RNase E 활성과는 무관하였고 경로 II는 RNase E 활성에 따라 나타났다. rne 의존자리의 염기서열이 바뀐 돌연변이체들의 시험관내 3' 가공반응 결과, 변화된 염기서열에 따라 가공경로가 선택되고 최종생성물의 3' 말단이 다르게 나타났다. 정확한 절단자리의 염기서열들의 분석결과는 가공반응의 활성과 절단되는 염기가 서로 상관관계가 존재함을 의미하였다.
