In recent years, immobilized continuous fermentation processes were steadily investigated for industrial purposes. Compared with suspended culture, an immobilized continuous process provides many advantages such as high productivity, high cell density, stability when a recombinant strain is employed, etc.. Especially, the usefulness of immobilization in the culture of fungal cells or Streptomyces sp., which have branched hyphal filaments, may be greater than that in the culture of bacteria or yeast because the fermentation broths of filamentous organisms are highly viscous and show the characteristics of non-Newtonian fluid. Due to this highly viscous broth, there may exist some problems, in the view point of bioprocess engineering, such as oxygen depletion by decreased mass transfer rate, heterogeneous mixing, and fouling of the process equipments, etc.. On the other hand, an immobilized culture has merits such as high mass transfer rate by lower viscosity, and the protection from shear damage as well as the advantages mentioned above.
Cyclosporin A, the model product in this study, is a cyclic peptide antibiotics composed of eleven amino acids. It is intracellularly produced as secondary metabolites by a strain of the filamentous fungus, Tolypocladium inflatum. Due to its remarkable selective immuno-suppressive effects, cyclosporin A (abbreviated as CyA) has been the focus of great interest in recent years.
In this study, CyA was produced by applying a two-stage continuous bioprocess, consisting of an immobilized perfusion reactor in the first stage and a suspended cell reactor in the second stage. In order to develop the two stage continuous process, media optimization for sporulation and CyA production, development of immobilized perfusion reactor system(IPRS) with an effective immobilized cell separator (decantor) were carried out.
In media optimization, a very effective medium for spore production of fungal cell was developed. By the use of the medium, several time-consuming sporulation steps in the previous immobilization procedure could be omitted, and a significant length of time could be reduced, for example from about 30 days to 8~10days. The prepared spore suspension was mixed with pretreated celite beads for 2 hours in a reactor. The spores were transported into bead pores by capillary suction. By allowing the spores to germinate and grow, we could entrap fungal hyphae inside the beads, and this completed the immobilization procedure. In the development of the medium for CyA production, the effects of major medium components such as carbon and nitrogen sources, and amino acids on the production of CyA were investigated for immobilized and suspended fungal cell cultures of Tolypocladium inflatum. As carbon sources in the medium, fructose and maltose stimulated CyA production remarkably compared with glucose when ammonium sulfate was supplemented as a nitrogen source. In the absence of ammonium sulfate in the medium, however, CyA biosynthesis was reduced considerably with no regard to the carbon sources tested. Ammonium sulfate was found to be the best nitrogen source, and also ammonium phosphate and ammonium citrate showed some positive effects on CyA production. Optimum concentration of ammonium sulfate was 10 g/L, and supplementation of ammonium sulfate at the start of fermentation was found to be the most effective. Among the constituent amino acids of CyA, L-valine had the most significant effect on the biosynthesis of CyA, and a maximum CyA production was observed when 10 g/L of L-valine was initially added.
An immobilized perfusion reactor system(abbreviated as IPRS) process was developed as the first stage in the two stage continuous process as mentioned earlier. In order to minimize beads loss to the effluent, several types of decantors which were essential to continuously separate immobilized cells from outgoing fermentation broth were designed and evaluated for efficient operations of the IPRS. In experiments employing highly viscous polymer (carboxymethyl cellulose) solutions, one of the decantors showed a good separating performance even for very high dilution rates. The air duct and cylindrical separator installed inside the decantor turned out to play key roles for the efficient separation of the immobilized cells. By installing the decantor, continuous operation of the IPRS was possible at high dilution rates for a long period, leading to high productivities of free cells and CyA. Almost no immobilized biomass existed in the effluent stream of the IPRS, demonstrating the effectiveness of the decantor system for a long-term continuous fermentation. It was noteworthy that we could obtain such results despite unfavorable conditions, i.e., reduced density of the immobilized phase (bead with immobilized cells) caused by overgrowth of cells on the bead particles and the existence of high density of suspended fungal cells (7g/L) in the fermentation broth, which caused a high broth viscosity.
Finally, the two stage continuous process was applied for CyA production. Productivities of CyA and cells were strongly influenced by the feed fructose concentration in the second stage($S_{02}$). Under the conditions of high $S_{02}$ of 30g/L, a significant reduction in CyA productivity was observed, possibly due to catabolite repression/inhibition caused by the high level of residual fructose. This phenomenon of catabolite repression/inhibition, however, was avoided by lowering $S_{02}$ to 10 g/L. The two stage continuous process showed an about 11 folds higher CyA productivity than a simple suspended cell batch culture. It was concluded that the developed process could be a very effective way for the production of many intracellular secondary metabolite as well as CyA.
A modelling and simulation study were carried out to find key factors affecting the CyA productivity. From the experimental data for simple suspended cultures, the model parameters were calculated and the resulting model agreed well with experimental result except for, the CyA concentration. The model should be improved before it can be used for the engineering study and optimization of the CyA production process.
고정상 연속발효공정은 산업적으로 꾸준히 검토되어 왔으며, 최근에는 의료용이나 분석용 목적에도 응용되고 있다. 현탁배양과 비교할 때, 고정상 연속배양은 높은 생산성, 고농도 세포배양, 재조합 균주 사용할 때의 안정성 등의 여러 가지 장점을 가진다. 특히 균사형성 미생물인 곰팡이류나 Streptomyces 종의 배양에 있어서는 고정상 배양의 장점은 더욱 부각되게 된다. 즉 이들 균주들의 배양은 배양액의 점도 증가와 비뉴튼 유체화라는 문제점을 가지게 되며 또한 고점도 배양액에 의한 물질전달속도의 감소에 기인한 산소고갈, 비균일 혼합, 장치의 fouling등의 생물공정공학 관점에서의 문제점이 상존할 수 있다. 한편, 고정상 배양은 배양액의 저점도에 기인한 물질전달속도의 향상, 전단응력으로부터의 보호 등, 위에 거론한 것 이외의 부가적인 장점들을 가진다.
이 연구의 모델 생산물인 cyclosporin A(CyA)는 11 개의 아미노산으로 구성된 polypeptide계 항생제로서 균사형성 곰팡이 Tolypocladium inflatum에 의해 이차대사산물의 형태로 세포내 축적된다. CyA는 놀라운 선택적 면역억제효과 때문에 최근 매우 각광받고 있다.
이 연구에서는 첫째 단계인 고정상 반응기와 둘째 단계 현탁 반응기로 이루어진 이단계 연속 발효공정에 의해 CyA를 생산하는 공정을 개발하고자 하였다. 이를 위해 포자 및 CyA 생산용 배지의 최적화와 효율적인 고정상세포 분리기를 포함하는 고정상 연속배양 시스템(immobilized perfusion reactor system ; IPRS)의 개발 등이 수행되었다.
배지 최적화에 있어서는 곰팡이의 포자 생산에 매우 효과적인 배지가 개발되었는데, 이 배지를 사용함으로써 기존 공정의 여러 단계가 생략되었고 준비시간 역시 약 30일에서 8 ~ 10일 정도로 대폭 단축되었다. 준비된 포자현탁액은 전 처리된 셀라이트와 혼합되었으며 이 과정에서 포자들이 모세관 현상에 의해 담체안으로 스며들었다. 그후 포자를 자라게 해줌으로써 담체내에 곰팡이 균사를 포괄(entrap)할 수 있었다. CyA생산용 배지의 개발에 있어서 탄소원, 질소원, 아미노산 등의 주요 배지성분이 CyA 생산에 미치는 영향을 Tolypocladium inflatum의 고정상 및 현탁 배양에 대해 조사하였다. 배지내의 탄소원으로서 fructose와 maltose가 ammonium sulfate 존재 하에서 glucose에 비해 CyA 생산을 자극하는 것으로 나타났다. Ammonium sulfate는 이 실험에서 최선의 질소원으로 나타났으며 이밖에 ammonium phosphate, ammonium citrate 역시 CyA 생산에 긍정적인 영향을 가지는 것으로 조사되었다. 최적 ammonium sulfate 첨가농도는 10 g/L였으며 초기 첨가 시에 가장 효과가 좋았다. CyA 구성 아미노산 중에서 L-valine이 CyA 생합성에 효과적으로 나타났으며 최대 CyA 생산은 초기 10g/L 첨가 시에 가장 높았다.
고정상 연속공정(Immobilized perfusion reactor system : IPRS)이 이단계 연속공정의 첫 단계로서 개발되었다. 유출되는 발효액에 의한 고정화 담체유출을 극복하기 위해 유출액으로부터 고정상 세포의 연속적인 분리에 필수적인 고정상세포 분리기를 설계하고 이를 제작, 그 성능을 시험하였다. 고점도의 고분자(carboxymethyl cellulose) 용액을 이용한 실험에서 개발된 분리기는 높은 유속 하에서도 좋은 분리능을 나타내었다. 이 분리기 내에는 공기유출관(air duct)과 분리관(cylindrical separator)이 설치되어 고정상 세포의 분리에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이 고정상세포 분리기를 이용하여 IPRS의 안정한 연속조업이 장기간 높은 희석속도에서도 가능하였으며 이에 의해 높은 균체 및 CyA 생산성도 얻을 수 있었다. 유실되는 담체가 IPRS의 유출액 중에 발견되지 않는 것으로 보아 그 세포분리기의 장기간 조업에 있어서의 효율성을 알 수 있었다. 더욱이 열악한 조업환경, 즉 고정상에 과잉성장된 세포에 의한 밀도감소와 고점도를 나타내는 고농도의 현탁 곰팡이세포(7 g/L)의 존재에도 불구하고 이런 결과를 얻을 수 있었다는 것은 주목할 만하다.
CyA 생산을 위한 이단계 연속공정이 적용되었다. 균체 및 CyA 생산성은 두 번째 단계 공급배지의 fructose 농도($S_{02}$)에 크게 영향을 받았다. 30 g/L의 높은 $S_{02}$ 조건에서는 심각한 CyA 생산성 감소가 나타났으며 이는 높은 농도의 잔당에 의한 대사억제/저해(catabolite repression/inhibition)에 의한 것으로 사료된다. 이러한 대사억제/저해는 $S_{02}$를 낮게 함으로써 극복할 수 있었다. 이단계 연속공정은 단일 현탁회분배양에 비해 약 11 배의 높은 CyA 생산성을 보였다. 개발된 공정은 CyA 뿐만 아니라 다른 많은 세포내 이차대사산물(intracellular secondary metabolite)의 생산을 위한 효과적인 방법으로 이용될 수 있을 것이다.
이단계 연속공정에 있어서 CyA 생산성에 영향을 미치는 인자를 알아내기 위해 모델링 및 전산모사를 수행하였다. 현탁 회분배양으로부터 모델 매개변수를 구했으며 모델과 실험결과가 잘 일치하였다. 얻어진 매개변수를 이용하여 이단계 연속공정에서의 CyA 생산성을 계산하였다. CyA의 전 생산성(overall productivity)은 전 희석속도 및 고정상 반응기에 대한 현탁 반응기의 비에 따라 감소했다. Non-growth associated term이 증가할수록 전 생산성도 증가하였다. 이 결과로부터 생합성물의 생산 패턴은 공정설계 및 운전전략을 결정하는 매우 중요한 인자임을 알 수 있었다.
