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Anticellular activity and temperature - sensitive release of target : selective liposomes = 목표 선택성 리포솜의 세포활성과 열민감성 방출거동에 관한 연구
서명 / 저자 Anticellular activity and temperature - sensitive release of target : selective liposomes = 목표 선택성 리포솜의 세포활성과 열민감성 방출거동에 관한 연구 / Jin-Chul Kim.
저자명 Kim, Jin-Chul ; 김진철
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 1997].
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초록정보

Until now, amphotericin B (AmB)-containing liposomes have been prepared by film swelling method. The liposomal AmB was less toxic than free AmB in vivo and in vitro. However, the toxicity of the liposomal AmB prepared by film swelling method is still high and should be reduced. Another problem, involved in the method, to be overcome is storage stability in buffer solution. The physical instability of liposomes, aggregation or fusion, may alter the inherent natures including size, lamellarity and assembling state of lipids, leading to the undesirable release of entrapped drugs. To overcome these shortcoming, two novel methods for the preparation of AmB-containing liposomes were designed. One is precipitation method and the other is spray drying. The liposomes containing AmB prepared by conventional film swelling method and precipitation method were investigated in terms of structure, stabilities and anticellular activities. The structure of liposomes were investigated with transmission electron micrograph, circular dichroism and X-ray diffraction. The stabilities of liposomes were studied in terms of release of AmB. Finally, the anti-cellular activities of the liposomal AmB were illuminated in view of the structure and the release of AmB. The liposomes prepared by spray drying method also were investigated in terms of size and anticellular activities. The liposomes containing AmB prepared by film swelling method exhibit much lower hemolytic abilities than free AmB. This is probably because of the presence of a non-toxic form of AmB-phospholipid complex. The presence of AmB-phospholipid complex in this formulation was confirmed by positive CD peak around 330 nm. This indicates that in egg PC/AmB/water system, AmB-phospholipid complex and AmB-containing liposomes would coexist. According to the result of DLS, a higher complexation give the particles of smaller size. With assay for AmB and phospholipid, the complex was AmB-rich and the liposome was AmB-poor. The hemolytic ability of the complex was lower than that of AmB-containing liposomes. In solubilization experiment, more favorable solubilization of the mixture of AmB and phospholipid than that of pure PC liposomes around 1 mM DOC also indicates the existence of the complex with high curvature. The precipitation method involves the precipitation of the drug and egg phosphatidylcholine (PC) into phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) or Tris buffered saline (TBS, pH 7.4) by evaporating methanol and chloroform around 4℃ under reduced pressure. The in vitro toxicities of the precipitated liposomes containing 3, 6, 9, 12 and 15 wt% AmB was compared with those of conventional liposomes containing the same contents of the drug. The hemolytic ability of the liposomes prepared by precipitation method at 37℃ at dose of 5 - 30 ㎍ AmB/ml for 17 hr was 30.1 to 50.3% of that of the conventional. In fact, the release of the drug from the precipitated liposomes was less than from the conventional. The less toxicity and the less release of the precipitated liposomes would come from the higher aggregation of AmB indicated by circular dichroism (CD) around 330nm. It is likely that the morphology of precipitated liposomes, probably AmB-core and lipid shell, give the properties such as the hemolytic ability, the release of AmB, the CD spectrum and the size distribution. Despite a lower toxicity of the precipitated liposomes, its activity against Candida albican was almost equipotent with that of the conventional. Thus, the less toxic but the equally active liposomes containing AmB could be obtained by the precipitation method. On the other hand, submicron-sized composite particles of AmB-phospholipid were prepared by spray drying method. The composite particles were prepared from small droplet of methanol solution of AmB and phospholipid. The ratio of AmB to lipid was kept to 2 : 8, varying the concentration of the solution from 0.17 to 1.80 mg egg PC/ml. The droplets were produced by a ultra sonic nebulizer and then methanol was evaporated by passing the droplets through a tubular heater maintained at $90\,^\circ\!C$. When lipid concentrations were low (0.0425 and 0.125 mg/ml), submicron-sized composite particles of AmB-phospholipid were obtained. However, at high concentrations (0.2075 and 0.45 mg/ml), particle-like shape get disappeared. When dispersed into PBS, the size of the composites increased with the concentration. The in vitro toxicity of particles was much lower than free AmB, maintaining most of its antifungal activities. A specially designed liposomes can regulate release of drug so that the drug may release in a controlled manner under specific stimuli, such as target, pH, temperature and light. Especially, for medical application, the most advanced medical application could be achieved by temperature sensitive liposomes. For this purpose, the surfaces of liposomes were modified with a hydrophobically modified poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) or copolymer of N-isopropylacrylamide (NIPAM) and acrylic acid (P(NIPAM-AA)). Liposomes mixed with a hydrophobically modified PNIPAM or P(NIPAM-AA) were investigated for the thermally-responsive release of drug. P(NIPAM-AA) copolymers with transition temperatures of about 30, 33, 37 and 43℃ were synthesized by copolymerizing NIPAM and acrylic acid. Thermally responsive liposomes were prepared by mixing hydro- phobically modified PNIPAM, or P(NIPAM-AA) with different liposomes, each composed of egg phosphatidylcholine (PC), dimyristoylphosphatidyl- choline (DMPC)/dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) mixture(5/5, wt/wt), DPPC or distearoylphosphatidylcholine (DSPC). If a liposomal membrane does not undergo phase transition during a temperature jump (17℃ → 20-46℃), liposomes of polymer with higher LCST start to release at higher temperature, as is the cases of egg PC and DSPC liposomes. Below 36℃ the DPPC membrane remained solid gel state, and the patterns of release from DPPC liposomes were similar to those of egg PC and DSPC liposomes. As is the case of DMPC/DPPC (5/5, wt/wt) liposomes, if phase transition occurred in the temperature region and the transitions of PNIPAMs did not occur, enhanced releases were observed equally by PNIPAMs. In the temperature from 36℃ to 46℃, where the phase transition of DPPC and polymers takes place, there was no difference of releases between liposomes of different PNIPAM. Thus, if the phase transition of liposomes occurred, the polymers destabilize liposomal membrane at the phase transition of liposomal membrane, even if there are no phase transition of polymers. The degree of release from REV of egg PC is much higher than that from sonicated one. And SUVs of DPPC and DSPC released their contents more readily than MLVs. This may be ascribed to the lamellarity of the each liposome. The incorporation of dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) of 30 or 50 wt% into the PC bilayer enhanced the release at 40℃ by 10-15%. This is probably due to the instability of the mixture bilayer. This result lead to preparing pure DOPE liposomes for a more temperature-sensitivity. A novel temperature-sensitive DOPE liposomes was prepared by coating the liposomes with hydrophobically modified PNIPAM. The optimal ratio of PNIPAM to lipid to stabilize the DOPE into a bilayer was 0.1. Around 29℃, which is below the lower critical solution temperature (LCST), around 32℃ , of the polymer, a release less than 10% was observed. However, above the LCST (e.g. 39℃), the liposomes release about 80 % of a entrapped calcein. From the results of dynamic light scattering and electron micrograph, a thermal contraction of PNIPAM would destabilize the liposomes. In fusion study measuring the fluorescence energy transfer between NBD-PE and Rh-PE, no fusion for 5 min over temperature range from 20 to 46℃ was observed. However, Instead of it, a marked aggregation of the liposomes occurred. This may be related to the extensive release from DOPE liposomes.

생리학적으로 유용한 물질의 전달자로 널리 연구되고 있는 리포솜을 이용하여 약물을 선택적 전달할 수 있는 연구를 수행하였다. 첫째, 정상 세포에 대하여 맹독성을 나타내는 항생제인 amphotericin B를 진균세포에 집중화 시키려는 목적으로 필름법, 침전법, 분무건조법으로 제조된 리포솜에 amphotericin B를 봉입시켜 세포에 대한 독성 및 활성, 그리고 리포솜의 물리적인 특성을 조사하였다. 둘째, 열 민감성 고분자인 poly(N-isopropylacrylamide)으로 리포솜 표면을 수식함으로써 특정 온도에서만 약물을 방출하는 열 민감성 리포솜을 제조하였다. 이 연구에서는 LCST가 다른 4 종류의 poly(N-isopropylacrylamide)를 합성하여 여러 종류의 리포솜 표면에 피복하였고 그 리포솜의 온도에 따른 형광물질 방출 거동을 관찰하였다. 현재까지AmB를 함유한 리포솜은 필름법으로 제조되었으며 그 리포솜에 봉입된 AmB는 in vivo와 in vitro에서 자유 AmB보다 독성이 훨씬 적었다. 하지만 필름법으로 제조된 AmB를 함유한 리포솜은 여전히 독성을 나타내기 때문에 그 독성을 감소시킬 필요가 있다. 또 다른 문제는 리포솜이 수용상에 존재하면 보관 안정성이 나쁘다는 것이다. 수용상에서 리포솜 입자의 뭉침과 융합과 같은 물리적인 불안정성과 인지질의 가수분해와 같은 화학적인 불안정성은 리포솜 입자의 크기, 층상구조 등과 같은 리포솜 본질을 변화시켜 보관 도중 약물이 방출될 수 있다. 이와 같은 독성과 안정성문제를 극복하기 위해서 새로운 방법인 침전법과 분무 건조법을 이용하여 AmB를 함유한 리포솜을 제조하였고 제조된 리포솜의 세포에 대한 활성 및 물리적인 특성을 조사하였다. 침전법은 메탄올과 완충용액의 혼합용매에 녹아 있는 AmB와 egg PC를 4℃ 에서 메탄올을 증발시켜 잔존하는 버퍼로 침전시키는 방법이다. 3, 6, 9, 12 그리고 15 wt% AmB를 함유한 리포솜을 침전법으로 제조하여 그것의 용혈능력을 필름법으로 제조한 리포솜의 용혈능력과 비교해 보았을 때, 5 ㎍ - 30 ㎍ AmB/ml 농도에서 침전법으로 제조된 리포솜의 용혈능력은 필름법으로 제조된 리포솜의 용혈능력의 30.1 내지 50.3%에 불과하였다. 이것은 침전법으로 제조된 리포솜으로 부터의 약의 방출이 필름법으로 제조된 리포솜으로 부터의 방출보다 적었기 때문이었다. 침전법과 필름법으로 제조된 리포솜에서 AmB의 결집정도를 330nm근처에서의 circular dichroism을 통해서 관찰하였는데 침전법으로 제조된 리포솜에서 약의 결집수가 높음을 알 수 있었다. 따라서, 침전법으로 제조된 리포솜의 용혈능력과 약물방출정도가 낮은 것은 침전법으로 제조된 리포솜에서 AmB의 결집수가 높다는 것에서 기인된 것 같다. 약의 결집체가 core이고 인지질이 shell인 복합입자가 침전법으로 제조된 리포솜의 형태가 될 수 있다고 추측된다. 한편, Candida albican으로 수행한 항진균성 실험에서는 그 항진균성이 필름법으로 제조한 리포솜의 그것과 거의 같았다. 따라서, 항진균성은 기존의 리포솜과 같으면서 독성이 낮은 AmB를 함유한 리포솜을 침전법으로 제조할 수 있었다. 한편, 수용액에서 리포솜을 보관할 때 불안정하다는 문제를 극복하기 위한 목적으로, 건조상태의 시료를 얻기 위하여 분무 건조법으로 AmB와 인지질의 복합입자를 제조하였다. 먼저 메탄올에 AmB 와 인지질을 2 : 8 (wt/wt) 비율로 녹인다. Ultra sonic nebulizer를 이용하여 메탄올 미세 액적을 형성시킨 후 공기 흐름을 이용하여 90℃로 유지된 관형 건조기를 통과시켰다. SEM 사진을 통해서 관찰한 결과 인지질의 농도가 낮을 때는 (0.0425 mg/ml그리고 0.125 mg/ml) 서브 마이크론 크기의 입자가 생성되었으나 인지질의 농도가 높을 때는 (0.2075 mg/ml 그리고 0.45 mg/ml) 입자 형상을 관찰할 수 없었다. 제조된 건조 시료를 완충용액에 분산시켜 DLS를 이용하여 크기를 관찰한 결과 메탄올 용액에서 인지질의 농도가 높을 수록 더 큰 입자가 생성되었음을 알 수 있었다. 복합입자의 세포독성은 자유 AmB보다 훨씬 더 적었고 세포활성은 자유 AmB보다는 다소 적었다. 이와 같은 건조 복합 입자는 AmB의 또 다른 제재가 될 수 있으리라 기대된다. 리포솜에 봉입된 약물이 목적세포, pH, 온도 그리고 빛과 같은 특정 자극에 의해서 선호적으로 방출될 수 있게 리포솜 막을 설계할 수 있다. 특히, 열 민감성 리포솜은 의약용으로 사용될 수 있는 잠재성이 가장 높다. 본 연구에서는 리포솜 표면을 열 민감성 고분자로 수식한 후 온도에 따른 형광 물질(calcein) 방출거동을 관찰하였다. N-isopropylacrylamide, acrylic acid 그리고 octadecylacrylate를 공중합하여 상전이 온도가 약 30, 33, 37 그리고 43℃ 인 공중합체(이하 P(NIPAM-AA))를 제조하였다. 이때 acrylic acid의 함량은 0, 1.09, 2.15 그리고 3.19%가 되도록 하였고 octadecylacrylate의 함량은 모든 중합에서 1 \%로 하였다. 각각의 공중합체를 리포솜 현탁액과 혼합한 후 온도에 따른 calcein 방출을 20 - 46℃ 범위에서 관찰하였다. Egg PC의 경우, 가장 낮은 상전이 온도를 나타내는 공중합체(acrylic acid함량이 0%인 공중합체)를 함유한 리포솜이 가장 낮은 온도에서 방출하기 시작하였고 반대로 상전이 온도가 가장 높은 공중합체를 함유한 리포솜이 가장 높은 온도에서 방출하기 시작하였다. 인지질에 대한 고분자의 중량비가 0.1일 때, 공중합체의 종류에 관계없이 80초 동안 방출된 정도는 상전이 온도 이하에서 5% 이하였고 온도가 상전이 온도에 근접할수록 약 20%에 달하였다. DSPC리포솜의 경우도 egg PC리포솜의 경우와 비슷한 방출 거동을 보였지만 egg PC 리포솜보다 온도 민감성이 우수하였다. 한편, DPPC 또는DPPC/DMPC(5/5, wt/wt)리포솜의 경우, 실험 온도 범위(20 - 46℃)에서 egg PC나 DSPC리포솜과는 달리 방출 시작 온도는 공중합체의 상전이 온도와 관계없이 리포솜막 자체의 상전이 온도에만 의존하였다 (사실, DPPC의 경우 36℃ 이하에서는 공중합체 상전이 온도를 어느 정도 반영한다). 다만, 방출 정도만이 공중합체의 영향으로 공중합체를 함유하지 않는 리포솜보다 향상되었다. 요약하자면, 실험 온도 범위에서 상전이를 겪지 않는 리포솜은 (egg PC, DSPC) 공중합체로 방출 시작 온도를 제어할 수 있지만 상전이를 겪는 리포솜(DPPC, DPPC/DMPC)경우 공중합체로 방출온도를 제어할 수 없음을 알 수 있었다. 리포솜의 제조방법 및 지질의 종류가 온도에 따른 리포솜의 방출정도에 미치는 영향을 관찰하였는데 이 연구에서는 PNIPAM 1(acrylic acid를 함유하지 않은 공중합체)만을 사용하였다. Egg PC의 경우 역상증발법으로 제조한 리포솜은 40℃에서 3분 동안 약 40% 방출을 보였고 그 이후에도 계속 방출하였으나 MLV는 15%에 불과한 방출을 보였다. 물론, 고분자의 상전이 온도 이하(24℃)에서는 두 경우 모두 5% 정도의 방출을 보였다. DPPC 그리고 DSPC 리포솜의 경우 SUV가 MLV보다 온도 민감성이 더 우수하였다. 이와 같이, REV와 SUV가 MLV보다 온도 민감성이 좋은 것은 각 리포솜의 이중층 수에 기인하는 것 같다. 한편, egg PC리포솜에 30-50% DOPE를 첨가시켰을 때 리포솜의 온도 민감성이 향상되었다. 리포솜의 온도 민감성을 더욱 향상시키기 위하여 PC를 함유하지 않은 DOPE리포솜을 제조하였다. 안정한 DOPE를 제조하기 위한 지질에 대한 PNIPAM의 비는 0.1었다(DOPE자체는 안정한 이중층 막을 형성하지 못한다). LCST이하의 온도인 29℃에서 10% 이하의 방출 %를 보였고 LCST이상의 온도인 39℃에서는 약 80%의 방출정도를 나타내었다. TEM이나 DLS로 관찰한 결과에 따르면, LCST이상에서 80%와 같은 높은 방출 %를 보이는 것은 DOPE리포솜이 PNIPAM의 열적 수축에 의해서 파괴되어 아마 hexagonal ($H_II$)로 되기 때문인 것 같다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCHE 97014
형태사항 xxi, 145 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김진철
지도교수의 영문표기 : Jong-Duk Kim
지도교수의 한글표기 : 김종득
수록 잡지명 : "Temperature-sensitivity of liposomal lipid bilayers mixed with Poly(N-isopropylacrylamide-co-Acrylic acid)". Journal of biochemistry, vol. 120
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학공학과,
서지주기 Reference : p. 137-145
주제 Liposomes
Amphotericin B
Toxicity
Antifungal activity
Poly(N-isopropylacrylamide)
Temperature-sensitivity
Release of calcein
리포솜
암포테리신
독성
활성
열민감성 고분자
열민감성 방출거동
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