Structural characteristics of antifungal protein, tenecin 3 has been investigated by CD and NMR in various condition. Tenecin 3 is composed of 78 amino acids and rich in glycine, glutamine and histidine. These residues occupy about 80% of entire sequence. Interestingly, tenecin 3 has 11 times repeated motif of Gly-X-X-Gly or X-Gly-Gly-X, where X is glutamine, histidine or leucine. CD experiments of His tag fused tenecin 3 showed that its secondary structure is mainly composed of unordered form. Although high helicity was induced in high concentration of TFE, it seems to originate from His tag fragment. pH did not affect structural change. To correlate the activity of tenecin 3 with cytoplasmic membrane, SDS micelle and liposomes composed of PC or PC:PG(3:1) were constructed. It was found that no special structural change was observed in these environments, indicating that tenecin 3 may not act on cytoplasmic membrane. Enterokinse was treated on tenecin 3 to eliminate His tag fragment, but surprisingly it was found that cleaved His tag fused tenecin 3 show fair affinity to metal resin. This suggests that intact tenecin 3 can be highly purified by the same method. Fermentation of E. coli encoding intact tenecin 3 was carried out to obtain large amounts of protein. CD experiments of tenecin 3 gave similar results like previous CD experiments. The portion of random coil and turn were estimated by about 50% and 40% in most conditions, respectively. NMR experiments showed that random property is dominated in tenecin 3, resulting from the facts that any NH/NH cross-peak was not seen in NOESY and amide cross-peaks was highly overlapped. Chitin binding assay was performed to correlate its activity with chitin. Although tenecin 3 showed some binding affinity to chitin, it is not clear if it actually act on chitin. It was also found that tenecin 3 does not have chitinase activity.
CD 및 NMR 분광법을 이용하여 항진균 단백질인 테네신 3의 구조적인 특징을 연구하였다. 테네신 3은 78개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 글리신, 글루타민, 히스티딘이 매우 많아 이들이 전체 아미노산 중에서 80% 이상을 차지한다. 특징적으로 이 단백질에는 [글리신-가-가-글리신], 또는 [가-글리신-글리신-가]와 같은서열이 11번이나 반복된다. 이때 '가'는 글루타민, 히스티딘 혹은 류이신에 해당된다. CD 분광실험 결과 히스티딘 인식 서열이 중합된 테네신 3은 대부분 일정치 않은 구조를 가지는 것으로 밝혀졌다. 높은 농도의 트리플루오르에탄올이 첨가된 조건에서 나선구조의 성향을 많이 드러냈지만, 이것을 히스티딘 인식 서열에서 비롯된 것으로 관찰되었다. 또한 중성에서 산성으로 pH가 변해도 구조적인 변화를 나타내지 않은 것으로 관찰되었다. 테네신 3의 작용을 세포막과 연관시켜 보기 위해서, SDS 마이셀과 인지질로 구성된 리포좀이 첨가된 조건에서 CD 분광실험을 하였으나 특별한 구조변화를 일으키지 않는 것으로 드러났다. 이것은 테네신 3가 적어도 단독으로는 세포막을 형성하는 인지질층에 직접 작용하지 않을 것임을 시사한다. NMR 분광실험을 하기 위해서는 필요없는 부분은 제거되는 것이 바람직할 뿐 아니라, 분석해야 할 데이터가 작아지기 때문에 엔테로키나제를 처리하였다. 이 과정에서 히스티딘 인식서열 부분이 제거된 테네신 3도 니켈 친화성이 있는 것으로 드러났다. 이것은 히스티딘 인식서열이 중합된 테네신 3를 정제하는 방법을 이용하여 같은 수준으로 테네신 3를 정제할 수 있음을 제시한다. 다량의 테네신 3를 만들기 위해서 발효기를 이용하여 대장균을 키웠고, 앞선 방법으로 정제하였다. 테네신 3의 분광실험 결과 일정치않은 구조와 굴곡 구조가 대부분인 것으로 드러났다. NMR 분광실험에서도 아마이드 수소-아마이드 수소간의 공명 피크가 전혀 나타나지 않을 뿐 아니라 아마이드 수소들의 공명 피크들의 상당히 중첩되어 나타난 결과로부터 테네신 3는 수용액상에서 대부분 일정치 않은 구조를 가지고 있지 않다고 결론지을 수 있다. 구조를 형성할 수 있는 조건이 어떤 것이 있는가 탐색하기 위해서 세포벽의 주요 성분인 키틴과 친화성이 있는가 살펴보았다. 테네신 3가 약간은 키틴과 친화성을 보이지만 실제로 키틴에 작용하는 지는 확실하지 않다. 아울러 키틴을 분해하는 활성은 없는 것으로 드러났다.
