The bacteriophage SP6 promoter consists of highly conserved 22 base pairs from -17 to +5. In order to determine the base pairs that are essential to the SP6 promoter function, a library of all possible single base-pair mutations of SP6 promoter was constructed by random mutagenesis. Relative transcription efficiencies of 66 SP6 promoter variants compared with the consensus SP6 promoter(wild type) were determined in vivo and in vitro; in vitro transcription was performed under 6 mM $MgCl_2$ and a linear template condition. Some mutations such as -10T → A, -3A → T, and +5C → G, showed higher transcription efficiency than wild type in vitro. Especially -3A → T mutant was more active than wild type both in vivo and in vitro. Mutations at position -11, from -9 through -5, and +1 seriously reduced promoter activity in vivo and in vitro, while mutations at -17, -16, -1, +4, and +5 had little effect on SP6 promoter function. Some mutations showed substantially different effects in vivo and in vitro; the -13T → C, -2T → A, -1A → C, and +3A → C mutations almost abolished in vitro efficiency but affected little in vivo, while -3A → T mutation almost abolished in vivo efficiency without affecting much in vitro. At several positions, SP6 RNA polymerase displayed a clear hierarchy of base-pair preference. The correlation of in vitro SP6 promoter activity with the presence and/or absence of specific functional groups in the region from -17 to -4 suggest that the followings are necessary for the interaction of SP6 promoter with SP6 RNA polymerase: (1) a hydrogen bond donor at the 4-amino group of the C and a hydrogen bond acceptor at the 6-keto group at the N7 position of the G at -11, -9, -7, and +5; (2) a hydrogen bond acceptor at the 4-keto group of the T or 6-amino group of the A at -9 and -4; (3) the T:A base pairing at -15 and -14.
박테리오파아지 SP6 전사촉진제는 -17 부터 +5 까지 22개의 염기쌍으로 구성되어 있다. 본 연구에서는 SP6 전사촉진제의 기능에 중요한 염기쌍을 결정하기 위하여 -17 부터 +5 부분에 대한 모든 한점 돌연변이를 유발시켜 전사촉진제의 활성에 미치는 영향을 알아보았다. Linear DNA를 주형으로 한 시험관 내 실험에서, -10T → A, -3A → T, +5C → G 같은 일부 돌연변이들은 야생형 SP6 전사촉진제보다 높은 활성을 나타내었다. 특히 -3A → T 돌연변이는 생체내와 시험관내 모두에서 야생형보다 높은 활성을 가졌다. -11과 -9에서 -5 까지 부분, 그리고 +1에서의 돌연변이는 SP6 전사촉진제의 활성을 급격하게 감소시켰다. 반면 -17, -16, -1, +4, +5에서의 돌연변이는 전사촉진제의 활성에 거의 영향을 미치지 않았다. 또한 일부 돌연변이들은 생체내와 시험관내에서 큰 차이를 보였다. 예를 들어 -13T → C, -2T → A, -1A → C, +3A → C 변이체들은 시험관내에서는 활성이 급격히 감소하였으나 생체 내에서는 전사 활성에 거의 영향을 미치지 않았다. -3A → T 돌연변이는 이와 반대의 결과를 보였다.
일부 위치에서 SP6 RNA 중합효소는 특정 염기쌍에 대한 강한 선호 경향을 나타내었다. -17에서 -4 부분에서 SP6 RNA 중합효소의 염기쌍 선호 경향을 분석해 본 결과 다음과 같은 작용기가 RNA 중합효소와 전사촉진제의 상호작용에 반드시 필요할 것으로 추측된다: (1) -11, -9, -7에서 hydrogen bond donor로서 C의 4-아미노기와 hydrogen bond acceptor로서 G의 N7 위치 또는 6-keto기, (2) -4 또는 -8 위치에서 T의 5-methyl 기나 hydrogen bond acceptor로서 A의 N7 위치 (3) -15와 -14에서 T:A 또는 A:T 염기쌍.
