HCV infections may cause, self-limited disease as well as more commonly chronic infections that result in chronic liver disease, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Therfore, there is an important need for a vaccine to protect against infectin by this virus. The induction of neutralizing antibodies of broad reactivity was hampered by several reasons; heterogeneous nature of HCV genome, high nutation rate, and hypervariable region in envelope proteins. As a preliminary step of induction of HCV-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL), we transfered MFG recombinant retroviral vectors, which contained the genes encoding HCV core protein and NS3 protein, into mouse cells, and then investigated the expression of two proteins. Cationic lipid-mediated gene transfer (lipofection) was employed as a transfection method. For the high-efficiency transfection, we optimized several factors which are known to be critical. The ratio of lipid to DNA, the length of time the cells are exposed to the lipid/DNA complexes, and the seeding density were determined on the basis of -galactosidase activity exhibited by a control reporter plasmid RSV- Gal. The synthesis of a core protein product approximately 21 kDa (P21) was confirmed, and a processed form of P21 was also detected. HCV NS3 protein of about 65 kDa was expressed in MFG recombinant retroviral vector DNA-transfected mouse cells. Bicistronic recombinant plasmids successfully led to synthesis of the two proteins.
C형 간염 바이러스는 급성 간질환 뿐만 아니라 만성적 간질환, 간경화 및 간암을 일으키는 주요한 병원체로 알려져 있다. 따라서 C형 간염 바이러스에 대한 백신의 개발이 시급한 실정이다. C형 간염 바이러스에 대한 중화 항체의 개발은 HCV 유전자의 다양성, 높은 돌연변이율, 외피단백질내의 hypervariable region 등의 이유로 큰 성과가 이루어지지 않았다. 최근에 이르러 C형 간염 바이러스에 대한 체액성 면역반응에 대한 정보가 축적되면서, cytotoxic T cell(CTL)이 중요함이 밝혀지고 있다. 본 실험에서는 C형 간염 바이러스에 특이적으로 작용하는 CTL을 유도하고자 하는 계획아래 예비실험으로, C형 간염 바이러스의 Core 단백질과 NS3 단백질을 지시하는 유전자를 생쥐세포 BNL CL.2에 도입하여 두 단백질의 발현 양상을 조사하였다. 유전자를 도입하는 벡터로써는 MFG 레트로바이러스를 이용하였다. 외부 DNA를 생체내로 전달하기 위해서 양이온을 갖는 지질과 DNA 사이의 상호작용을 이용하는 Lipofection 방법을 도입하였다. Transfection 효율에 큰 영향을 미친다고 알려진 DNA 대 지질의 비율, 세포가 lipid/DNA 복합체에 노출되는 시간, 세포 농도 등에 대해 최적화 실험을 수행하였다. 최적화된 조건을 사용하여 Core 및 NS3 유전자를 세포내로 도입시켰을 때 해당되는 단백질이 발현됨을 확인하였다. Core 단백질의 경우, 21kDa의 크기를 갖는 예상된 단백질과 함께 유사한 크기의 processing된 형태의 단백질이 발현됨을 보았다. NS3 단백질의 경우, 약 65kDa의 단백질이 발현되었다. 두 단백질이 동시에 발현되도록 구성된 DNA에서도 상응하는 단백질이 성공적으로 발현되었다. 이는 이들 단백질이 생체내에서 발현되었을 때 CTL epitope로 작용할 수 있는 가능성을 제시한다.
