A PCR-based random mutagenesis was performed to study the active site of the D-amino acid aminotransferase of Bacillus sp. YM-1. A mutant enzyme showing higher affinity to D-valine was selected and the DNA sequence was determined. It was found that the mutation of the $Val^{33}$ residue to alanine was responsible for the enhanced affinity to the branched substrate. This residue was observed in the b-strand III of D-AAT which formed by the amino acid residues from the $Val^{30}$ to the $Val^{36}$ residues and was located across the active site of D-AAT. The odd-numbered amino acids ($Tyr^{31}$, $Val^{33}$, and $Lys^{35}$) in the strand were revealed to be directed toward the active site. Interestingly, the $Glu$^{32}$ was also directed the active site. Studies were focused on the involvement of these amino acid residues in catalysis by alanine scanning mutagenesis. The Y31A and E32A mutant enzymes showed a remarkable decrease in the $k_{cat}$ value, retaining less than 1% of the wild-type enzyme activity. The $k_{cat}$ values of V33A and K35A changed only slightly, but the $K_m$ of K35A for α-ketoglutarate increased to 35.6mM, compared to the $K_m$ value of 2.5mM of the wild-type enzyme. These results suggested that the positive charge at $Lys^{35}$ interacted electrostatically with the negative charge at the side chain of α-ketoglutarate.
Site-directed mutagenesis of the $Glu^{32}$ residue was conducted to demonstrate the role of this residue in detail. From the kinetic and spectral characteristics of the $Glu^{32}$-substituted enzymes, the $Glu^{32}$ residue seemed to interact with the positive charge at the Schiff base formed between the aldehyde group of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) and the ε-amino group of $Lys^{145}$ residue. Because the charge interaction of the $Glu^{32}$ residue with the $Lys^{145}$ residue was supposed to affect the formation and the stabilization of the enzyme-substrate complexes, studies were proceeded to investigate the changes of the ES complexes. The reaction of the wild-type D-AAT with D-serine resulted in accumulation of significant amount of the quinonoid intermediate, showing an apparent molar extinction coefficient of $7410 M^{-1} cm^{-1}$. The $Glu^{32}$-substituted mutant enzymes exhibited different extinction coefficients in the presence of D-serine, thus indicating accumulation of different amounts of the quinonoid intermediate. It is likely that the presence of the hydrogen-bond donor with an appropriate length at the $32^{nd}$ residue is crucial for the stabilization of the quinonoid intermediate. In addition, the negative charge at the $Glu^{32}$ residue was found to make a significant contribution to fast decay of the quinonoid intermediate and formation of the α-aminoacrylate intermediate. when reacted with β-chloro-D-alanine. Previous observation that the substitution of the $32^{nd}$ residue caused a significant change in the catalytic activity of the enzyme could be attributed to difference of the degree of stabilization of the positive charge at the $Lys^{145}$ residue.
Bacillus sp. YM-1 유래의 D-amino acid aminotransferase (D-AAT) 의 활성부위 연구를 위하여 PCR 을 이용한 random mutagenesis 를 수행하였다. 분리된 돌연변이 D-AAT 유전자의 염기서열을 조사 한 결과 D-AAT 단백질 서열중 33번 valine 잔기의 alanine 으로의 돌연변이가 D-valine 에 대한 높은 활성에 중요한 역할을 할 것으로 기대되었다. 33번 잔기는 D-AAT 단백질 3차 구조상에서 $Val^{30}$ 에서 $Val^{36}$ 까지의 잔기들로 이루어진 β-strand III 에 속해 있었으며 이 β-strand 는 D-AAT 의 활성부위로 생각 되는 부분을 걸쳐서 존재함을 알 수 있었다. β-strand 에 포함되어 있는 아미노산 잔기들 중, 특히 홀수번 아미노산 잔기들 ($Tyr^{31}$, $Val^{33}$, $Lys^{35}$)의 side chain 들은 활성부위의 안쪽으로 향해 있었다. 특이하게도 짝수 번인 $Glu^{32}$의 carboxylic group 또한 활성부위의 안쪽으로 향하여 D-AAT 활성에서 catalytic base 역할을 하는 $Lys^{145}$ 잔기에서 약 5 angstrom 떨어진 거리에 위치하였다. 따라서 β-strand III 에 포함된 각 홀수번 아미노산 및 $Glu^{32}$를 alanine 으로 치환하여 각각의 역할을 연구하였다. Y31A 및 E32A 돌연변이 효소의 경우 효소의 활성을 나타내는 $k_{cat}$ 값이 크게 감소하여 wild-type 의 1% 미만의 활성을 보였다. V33A 및 K35A 돌연변이 효소들은 활성을 거의 유지하는 것으로 판명되었다. 그러나, K35A 는 기질인 α-ketoglutarate 에 대한 친화성이 35.6mM 로서 wild-type 효소에 비하여 15배 정도 감소된 결과를 보였는데, 이는 K35A 효소의 lysine 잔기가 alanine 으로 치환됨으로써 음전하를 띈 기질의 side chain 과의 정전기적인 서로간의 작용이 없어졌기 때문인 것으로 해석되었다. V33A 효소의 경우 bulky side chain 을 가진 α-ketoisovalerate 에 대한 친화성이 wild-type 효소에 비하여 2-3배 증가한 결과를 보였다. 따라서, Y31, E32 잔기는 효소의 촉매활성에 중요한 역할을 할 것으로 생각되었으며, V33, K35 잔기는 기질의 결합부위에 위치한 것으로 추정되었다. 이들중 E32 의 상세한 역할을 E32D, E32Q 및 앞서 얻어진 E32A 돌연변이 효소들을 통하여 관찰하였다. E32 돌연변이 효소들의 동력학적 (kinetic) 분광학적 특성들로부터 $Glu^{32}$ 잔기가 활성부위의 Schiff base (internal aldimine) 의 양전하의 안정화에 기여를 하는 것으로 추정할수 있었다. 이러한 $Glu^{32}$ 잔기의 특성은 바로 기질과 조효소인 pyridoxal phosphate 와의 Schiff base 결합인 external aldimine에도 비슷한 효과를 미쳤다. β-chloro-D-alanine 과의 반응결과 32번 위치의 음전하는 활성부위 $Lys^{145}$ 잔기의 catalytic base 역할을 반응산물인 양전하를 안정화시킴으로서 증대시키는 결과를 보였다. 또한 D-serine 과의 반응 결과 반응 중간산물인 quinonoid intermediate 의 축적에 결정적인 작용을 하였으며, 이러한 quinonoid 의 안정화는 D-seine의 β-hydroxy group과 $Glu^{32}$ 잔기의 δ-carboxylic group 및 $Lys^{145}$ 잔기의 ε-amino group 간의 두개의 수소결합에 기인하는 것으로 추정되었다.
