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Statistical approach to development of neovel method for lysophospholipid synthesis by lipase = 리파제를 이용한 라이소포스포리피드 합성방법 개발을 위한 통계적 접근
서명 / 저자 Statistical approach to development of neovel method for lysophospholipid synthesis by lipase = 리파제를 이용한 라이소포스포리피드 합성방법 개발을 위한 통계적 접근 / Jeong-Jun Han.
저자명 Han, Jeong-Jun ; 한정준
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 1997].
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Lysophospholipids have been widely studied as new emulsifying agents, pharmaceutical agents and food preservatives. Lysophospholipids also have several physiological functions. They mediate several cellular mechanisms. Especially, many researches on lysophosphatidic acid(LPA) are in rapid progress. The increasing awareness of the importance of LPA's role in physiological events has a great impact on lysophospholipid research. A better understanding of LPA's role in platelet aggregation and pathophysiology could aid in the prevention or treatment of thrombotic events and could also contribute to the development of posthemorrhagic vasocontriction. It has been known that the kind of fatty acid in lysophospholipid is important in biological activity. Therefore, for the synthesis of these biologically useful lysophospholipids with desired fatty acid, easy and simple synthetic approach has been needed. In current chemical synthesis of lysophospholipid, very toxic and expensive solvents are being employed. Especially if the products are intended for use as clinical or pharmaceutical materials and food ingredients, toxic solvent should be avoided. And also substrates should be protected or modified for the stereospecific acylation of fatty acyl group. It has been known that the yield of lysophospholipid low in chemical synthesis. Therefore, for the lysophospholipid syntheis with desired fatty acid, several enzymes such as phospholipase $A_2$ and phospholipase D are being used currently. But it is difficult to obtain those enzyme sources in large quantity and these are very unstable and too expensive. In addition, substrates for this enzymatic reaction are also very expensive and is difficult to be synthesized. Lipase has a broad substrate specificity and can be obtained in large quantity and cheap. The function of 1,3-specific lipase is similar to that of phospholipase A1, hence 1,3-specific lipase can be substituted for phospholipase A1. So, it was plausible to synthesize lysophospholipid by esterification or transesterification of glycerol-3-phosphoryl group with fatty acids, fatty acid esters or triglycerides in the presence of lipase. Thus, lysophospholipid could be synthesized from glycerolphosphoryl group with free fatty acid by lipase-catalyzed esterification. In other words, we could acylate useful fatty acid by this method. In an organic solvent system lysophospholipid synthesis was low, which might be resulted from low solubility of the substrate. On the other hand, lysophopholipid could be synthesized well in a solvent free system. There are various parameters that govern this lysophospholipid synthesis reaction. Especially, water activity($a_w$) was very important factor. The optimal $a_w$ should exist in most organic synthesis by hydrolase and we could obtain higher reactivity at that point. Maintaining optimal $a_w$ during the reaction can increase the yield and reaction rate because the reaction condition at optimal $a_w$ could be maintained longer. Salt hydrate pair could act to buffer optimal water level during the esterification reaction. We investigated the effect of various salt hydrate pair for $a_w$ control on the lysohospholipid synthesis in a solvent free system. The optimal $a_w$ for LPA, lysophosphatidylethanolamine(LPE) and lysophosphatidylcholine(LPC) were 0.18, 0.37 and 0.60, respectively and those were controlled by NaI(2/0), $CH_3COONa(3/0)$, and $Na_4P_2O_7(10/0)$ hydrate pair, respectively. Especially, in the case of LPE synthesis, $a_w$ is a 50℃, and 0.18 of $a_w$. Thus, Biologically useful LPA with desired fatty acid could be produced at high yield and low variance under the various environmental noise factors.

라이소포스포리피드는 강력한 유화제로서, 또한 의약제로서 식품 첨가물로서 활발히 연구되고있는 물질이다. 특히 이들의 생체내의 신호전달체계에의 관여가 최근 밝혀짐에 따라 관심이 매우 고조되고 있다. 이들 라이소포스포리피드 중 라이소포스포티딕산의 생리학적 성질이 매우 중요시 되고 있으며 혈액응고기작 및 병리학적 기작에 관한 성질이 밝혀짐에 따라 이들의 연구가 더욱 활발해지고 있다. 이들의 성질은 함유하고 있는 지방산에 따라 다르다고 알려져 있다. 특정 지방산을 가진 라이소포스포리피드류의 합성 방법으로 현재 사용되고 있는 방법으로 우선 화학적 방법이 있는데 매우 독성이 있는 용매를 사용할 뿐 아니라 입체선택적인 아실화를 위해 기질에 보호그룹을 사용하는 과정을 여러번 반복해야 하는 등 효과적이지 못할 뿐만 아니라 수율도 낮은 것으로 알려져 있다. 그리하여 생물학적인 방법을 병행하여 합성이 되고 있는데 이때에 사용되는 기질은 화학적으로 합성되고 있으며 매우 고가인데다 사용되는 효소로 포스포리파제 $A_2$와 포스포리파제 D가 사용되고 있는데 이 또한 매우 고가이며 반응시 여러 가지 보효소가 필요하며 대량으로 얻기도 어렵다. 또한 일반적으로 효소의 안정성도 좋지 못하다. 따라서 단순하면서도 경제적인 각 유용 지방산을 가진 라이소 포스포리피드류의 합성 방법이 요구되고 있다. 지방분해 효소인 리파제는 기질 특이성이 넓어서 다양한 에스터 결합을 끊거나 결합하는데 이용되고 있다. 라파제는 포스포리파제를 대체할 수 있으며 대량으로 값싸게 얻을 수 있다. 본 연구에서는 리파제를 이용하여 원하는 특정 지방산을 가진 라이소포스포리피드 합성 방법을 개발하고자 하였다. 이를 위하여 글리세롤포스포릴 그룹에 지방산, 지방산에스터, 또는 트리글리세라이드를 이용하여 에스테르화 및 트랜스에스테르화 반응을 각각 유기용매 시스템과 유기용매가 없는 시스템(solvent free system)에서 시도해 본 결과 유기용매가 없는 시스템에서 지방산을 이용한 에스테르화반응이 가장 적합한 시스템임을 알 수 있었다. 라이소포스포리피드 합성에 미치는 여러 가지 인자 중 수분활성도가 가장 중요하였으며 이는 미수계 반응에서 반응 시스템의 수분활성도가 효소의 활성에 매우 중요하기 때문이다. 본 연구에서는 라이소포스포리피드류의 합성 반응 시스템의 최적 수분활성도를 찾아내고 그 수분활성도를 유지시키는 방법으로 염수화물 쌍을 반응 시스템에 첨가하거나 반응기의 head space에 둠으로써 반응 시스템의 최적 수분활성도를 유지시켜 줌으로써 반응속도 및 수율을 증가 시킬 수 있었다. 라이소포스파티딕산과 라이소포스파티딜콜린 및 라이소포스파티딜 에탄올아민 합성의 최적 수분활성도는 각각 0.18, 0.37, 0.60으로 이들은 각각 NaI(2/0), $CH_3COONa(3/0)$, $Na_4P_2O_7(10/0)$에 의해 조절되었으며 기질의 친수성이 높을 수록 최적 수분활성도 값이 높았다. 특히 라이소포스파티딜에탄올아민 합성의 경우는 수분활성도를 조절하지 않으면 거의 합성되지 않았다. 라이소포스포리피드 생산 최적화를 위해 라이소포스파티딕산 생산을 모델로 하였다. 최적화 방법으로 다구찌 방법을 이용하였다. 많은 설계연구가 실험실에서 행해지게 되는데 참다운 설계연구가 되기 위해서는 연구실의 결과가 생산 현장에서 재현되어야 한다. 일반적으로 process의 특성에 있어서 목표치를 유지하지 못하게 하고 변동을 야기시키는 요인들이 있다. 이들을 잡음인자(noise factor)라 부르는데 이러한 인자들은 실험실에서의 많은 최적화 연구를 실제 생산 시스템에서 맞지 않게 한다. 이러한 잡음인자를 제어하는 것은 불가능하거나 가능하더라도 매우 비용이 많이 들게 된다. 다구찌 방법에서는 이러한 다양한 잡음하에서도 process의 특성이 일정하도록 하는 최적화방법으로서 반응 시스템에 영향을 미치는 강력한 주효과들을 찾아내고 시스템에 크게 영향을 미치는 잡음들을 찾아내고 이들 잡음하에서 process가 이들 잡음에 영향을 받지 않도록 하는 주효과들의 적절한 조건을 찾아내어 잡음을 제어하지 않으면서도 process의 변동이 없도록 설계함으로서 실제 생산시 예기치 못했던 여러 잡음하에서도 목표치에 도달하도록 하게할 수 있다. 라이소포스파티딕산 합성에 영향을 미치는 중요한 인자로서 반응온도와 교반속도, 기질의 몰비율, 반응시간, 수분활성도였다. 본 반응 시스템은 반응 시스템의 수분함량이 매우 중요하다. 따라서 기질 및 효소의 초기수분함량은 다양한 조건을 나타낼 수 있으며 이들은 수율의 변동을 야기시키는 잡음인자가 될 수 있다. 이들 잡음인자를 제어하지 않고 조절이 용이한 주 인자들 즉 반응온도, 교반 속도, 기질의 몰비율, 반응시간, 수분활성도들의 적절한 조합을 찾아 내어 높은 수율을 가지면서 변동이 적은 라이소포스파티딜산 생산시스템을 결정하였다. 결정된 최적 조건은 50℃, 400RPM, 기질 몰비율 40:3(지방산:글리세롤-3-포스페이트), 60시간, 수분활성도 0.18 이었으며 이 조건에서 라이소포스파티딜산의 수율은 85.4% 였으며 분산은 5.89로 매우 낮았다. 따라서 본 연구는 다구찌 방법을 라이소포스파티딜산 생산 시스템의 최적화에 이용하였으며 그 결과 process의 큰 변동 요인인 기질이나 효소의 초기 수분 함량에 관계없이 일정한 수율을 얻을 수 있는 매우 경제적이며 효과적인 생산시스템이 될 수 있었다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 97011
형태사항 ix, 113 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 Appendix : 1, Assay method for the monitoring of LPC and LPE synthesis. - 2, Water activity control by direct addition of salt hydrate pair for LPC and LPE synthesis in a solvent free system
저자명의 한글표기 : 한정준
지도교수의 영문표기 : Joon-Shick Rhee
지도교수의 한글표기 : 이준식
수록 잡지명 : "Lipase-catalyzed synthesis of lysophosphatidic acid synthesis in a solvent free system". Biotechnology Letters. Chapman \& Hall, vol. 17, pp. 531-536
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생물과학과,
서지주기 Reference : p. 109-111
주제 Taguchi's method
Optimization
Lipase
Lysophospholipid
Water activity
다구찌방법
최적화
리파제
라이소포스포리피드
수분활성도
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