Hepatitis C Virus (HCV) is the major etiological agent of non-A, non-B post-transfusion hepatitis. Its genome, a (+) stranded RNA molecule of about 9.4 kb, encodes a large polyprotein that is processed by viral and cellular proteases into at least nine different viral polypeptides. NS3 (non-structural) protein has a sequence motifs of a serine protease at N-terminal 1/3 fragment, and a sequence motifs of a NTPase/DEXH RNA helicase at C-terminal 2/3 fragment. The carboxy terminal 3/4 fragment (466 a.a) of the HCV is expressed in E.coli with T7 promoter and His-tag purification system and designated as NS3H. NS3H has a polynucleotide stimulated NTPase activity, and an RNA helicase activity. The NS3H requires ATP and divalent cations such as $Mg^{2+}$ and $Mn^{2+}$ for RNA helicase activity. NS3H is able to utilize any nucleotide for RNA helicase activity, and it shows optimum activity at 3 mM divalent ion, and pH 6.5. The minimal size for the full enzymatic activity of the NS3 protein is 400 amino acid fragment which is deleted 16 amino acids from N-terminus, and 50 amino acids from C-terminus of NS3H. The contribution of the individual residues in conserved sequence motifs of NS3H which is a member of DEXH RNA helicase is investigated by mutational analysis and biochemical assays. Lysine residue in AXXXXGKS plays important role in NTPase activity and in coupling the NTPase activity with the RNA helicase activity. Not all the amino acids can occupy the X residue in DEXH motif of HCV NS3 RNA helicase. At least serine cannot be X residue. NTPase activity of the NS3H could be increased by substitution of histidine with alanine, and this implies that the DEXH motif is crucial for NTPase activity. TAT motif is involved in RNA unwinding activity of the NS3H The QRRGRTGR motif is not important in RNA binding but, is involved in NTP hydrolysis and consequently in RNA unwinding activity. The Gln residue, the second, third and forth arginine residues are indispensable for NS3 NTPase, and RNA helicase activities. It can be summarized that above 4 conserved helicase motifs are important in overall protein function, and the strictly conserved residues in the motifs are more important than other residues.
C형 간염 바이러스는 비A, 비B형 간염의 주요 병원체이며, 만성간염의 50 - 60% 이상을 차지하고 간경색과 간암과도 밀접한 관계가 있다. HCV의 게놈은 약 9.4 kb의 (+) 가닥 RNA이며, 이 유전자로부터 한 개의 복합단백질이 만들어지고, 이 단백질은 바이러스나 숙주의 단백질 분해효소에 의해 9개 이상의 단백질로 나뉘어 진다.
비구조 단백질인 NS3 단백질은 N-말단부의 1/4부위에 세린 단백질 분해효소의 sequence motif를 가지고 있으며, C-말단부 3/4 부위에 NTPase/DEXH RNA 나선효소 sequence motif를 가지고 있다. NS3 단백질의 C-말단부 3/4 절편(466 아미노산)을 T7 프로모터와 His-tag 순수분리 시스템을 사용하여 대장균에서 발현시켜 순수분리하였으며, 이 단백질은 NS3H라고 명명하였다. NS3H 단백질은 폴리누클레오티드에 의해 향상되는 NTPase 활성과, RNA 나선효소 활성을 가진다. NS3H 단백질은 RNA 나선효소 활성을 위해 ATP와 $Mg^{2+}$나 $Mn^{2+}$와 같은 2가 양이온이 필요하다. NS3 H단백질은 또한 RNA 나선효소 활성을 위해 어떠한 종류의 누클레오티드도 사용할 수 있으며, 양이온 농도 3 mM, pH 6.5 에서 최적의 활성을 나타내었다.
NTPase와 RNA 나선효소 활성을 나타내기 위한 NS3 단백질의 최소한의 크기는 NS3H로부터 N-말단의 16 아미노산, C-말단의 50 아미노산이 결실된 400 아미노산으로 구성된 단백질이었다. NS3H의 아미노산 서열중 다른 DEXH 아미노산 서열을 가진 RNA 나선효소와 높은 유사성을 보이는 sequence motif를 이루는 아미노산의 역할을 돌연변이를 도입하여 조사하였다. AXXXXGKS motif의 라이신 잔기는 NTPase 활성과 NTPase/RNA 나선효소 활성의 연결역할에 중요하다. 모든 아미노산이 DEXH motif의 X 잔기로 될 수는 없다. 세린은 X 잔기로 될 수 없었다. NS3H의 NTPase 활성은 DEXH motif의 히스티딘을 알라닌으로 치환시켰을 때 향상되었는데, 이것은 DEXH motif가 NTPase 활성에 중요함을 나타낸다. QRRGRTGR motif는 RNA 부착에는 중요하지는 않지만, NTPase 활성과 RNA 나선효소활성에 관여한다. 이 실험에서 조사된 4 개의 sequence motif들은 NS3H 단백질의 효소활성에 중요하며, 보존적인 아미노산 잔기들의 역할은 특히 중요하다.
