Chemical modifications of red blood cells (RBC) were performed to develop blood substitute which was universially transfusible, stable and active in oxygen transport. As a chemical modification reagents,we used methoxy-polyethylene glycol(mPEG),glutaraldehyde(GA),divinylsulfone(DVS) and bezafibrate(BZF).To evaluate the chemically modified RBCs as a blood substitute,it was performed that membrane protein analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, blood group typing with anti-A,-B and-D antiserum, hemagglutination test, antibody binding test,oxygen equilibrium curve analysis and osmotic fragility curve analysis. Human Rh(+) AB type RBCs were modified with methoxy-polyethylene glycol(mPEG) in order to decrease agglutinabilities toward clinically important anti- A,anti-B and anti-D reagents. Attachment of mPEG to membrane proteins of the RBC was identified by the shift of well-known blood group active glycoprotein bands such as band 3, 4.5 and PAS-1 on the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. When 4 mM concentration of mPEG was added to RBCs, agglutination was minimum by a blood group typing and microwell agglutination tests. Antibody binding tests showed decreased antibody binding was the result of mPEG attachment to blood group active glycoprotein of the cell membrane. The morphology of RBCs after mPEG attachment was the usual discocytic cell. Oxygen equilibrium curves of the mPEG attached RBCs were similar to unmodified RBCs. This approach to decrease agglutinability of the RBCs toward blood group antibodies may be used to develop a universially transfusible blood substitute.
However, this mPEG attached RBCs were less stable in osmotic fragility against NaCl concentrations than unmodified RBCs. This unstability would be overcomed by crosslinking of the RBCs. RBCs were crosslinked with glutaraldehyde by using a hemodialyzer which is used as artificial kidney. Human RBC,which was flowed in a flow of 2 ml/min flow rate, was extensively crosslinked with 50 mM GA solution of 10 ml/min flow rate.The crosslinked RBC showed high stability against osmotic pressure. The oxygen transport activity of the crosslinked RBC was similar to ummodified RBC. This crosslinking method could be used for the development of an stable blood substitute. To prevent easy hemolysis of the mPEG attached RBC, GA crosslinking method was applied to the modification of mPEG-RBC. This GA crosslinked and mPEG attached RBC showed high stability against osmotic pressure, decreased agglutinability and decreased binding of the blood group antibodies. The estimated % oxygen delivery was decreased from 34.79 to 25.66 at 4mM mPEG treat followed 2 mM GA (20 min)treated RBC. When BZF was added to the reaction mixture of mPEG-GA modification to improve the oxygen transport activity, the oxygen transport activity was increased to 33.5 %. This mPEG-GA-BZF modified RBC was stable, universially transfusible and highly active in oxygen transport.
수혈에 필요한 혈액의 부족은 오랜동안 심각한 문제였다. 최근들어 외과 수술기술의 발전과 수술빈도의 증가에 따라 그 수요는 점점 더 증가해 왔다. 더구나 간염이나 후천성면역결핍증 등 수혈을 통한 질병의 감염 위험으로 인해 헌혈량은 감소하고 있다. 또한 혈액형간의 거부반응 때문에 동종 혈액형간에만 수혈이 가능하다는 것도 혈액부족의 큰요인이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 혈액형의 구분이 필요없고, 수혈에 의한 감염의 위험이 없으며, 장기간 보존이 가능한 대체혈액의 개발이 시급한 실정이다. 대체혈액이란 혈액중의 적혈구내 헤모글로빈이 수행하는 폐조직에서 각 말초조직으로의 산소전달기능을 대신할 물질을 말한다. 현재 대체혈액으로 개발하고자 연구는 주로 헤모글로빈의 화학수정에 의한 방법이다. 본 연구에서는 아직 그연구가 미미한 적혈구의 화학수정에 대한 연구를 통해 혈액형간 거부반응이 없고 장기간 보관할 수 있게 안정한 적혈구를 개발하는 것을 목적으로 한다.
적혈구를 대체혈액으로 개발함에 있어서 가장 중요한 점은 적혈구가 가지는 혈액형항원의 제거이다. 현재 사람의 혈액형항원은 약 200 종류가 밝혀져 있고 이들은 22개의 혈액형군과 몇개의 collections으로 분류되어 있다. 이들 혈액형 항원들은 크게 단백질에 기인하는 항원(protein dependent antigens; Rh, $Wr^b$)과 탄수화물에 기인하는 항원(carbohydrate dependent antigens; ABH, Lewis, Ii)으로 나뉘어진다. 이들 항원들은 모두 구조의 일부분이 서로 다른 형태를 가짐으로서 서로 구분된다. 이러한 차이를 혈액형항체가 구분하지 못하게 하는 방법으로 본 연구에서는 메톡시폴리에틸렌글리콜 (mPEG)에 의한 적혈구의 화학수정을 시도하였다. 메톡시폴리에틸렌글리콜에 의한 단백질의 화학수정은 단백질의 항원성과 면역성을 감소시키고 혈액내에서의 잔류시간을 증가시킨다고 많은 연구자들에의해 보고되었었다. 이러한 효과는 단백질표면에 결합한 긴 사슬모양의 mPEG가 항원주위를 감싸 항체의 접근을 억제한다는 이론에 근거한다.
적혈구의 화학수정에는 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG), 글루타르알데하이드(GA), 디비닐술폰(DVS) 및 베자피브레이트(BZF) 등을 사용하였다. 화학수정된 적혈구가 대체혈액으로서 어떠한 가치가 있는가를 확인하기 위해 적혈구 막단백질의 분석, 면역혈청학적 분석, 산소전달능력의 확인, 삼투압에 따른 용혈정도의 분석 등을 행하였다. 그 결과, 메톡시 폴리에틸렌글리콜은 적혈구의 혈액형항원 부근의 막단백질과 결합하여 혈액형 항혈청(Anti-A, B, D antiserum)과의 반응에서 응집성이 감소하였다. 이러한 응집성의 감소는 메톡시폴리에틸렌글리콜이 적혈구막 위의 혈액형 항원에 혈액형 항체의 결합을 억제하기 때문임을 알 수 있었다. 또한 산소전달능력과 화학수정 후의 적혈구 형태가 화학수정 이전의 적혈구와 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 삼투압에 따른 용혈의 정도가 심해 안정성이 감소하였음을 알 수 있었다.
글루타르알데하이드 수정은 적혈구를 매우 안정하게 하였다. 이는 글루타르알데하이드가 적혈구막의 단백질뿐만아니라 적혈구내의 구조형성 단백질과 헤모글로빈들도 crosslinking하기 때문이다. 슬라이드 위에서의 혈액형 판정시험에서는 글루타르알데하이드의 농도가 증가함에 따라 응집성의 감소는 보였으나 마이크로웰시험에서는 응집성의 감소와 혈액형항체의 결합감소를 관찰할 수 없었다. 이는 글루타르알데하아드에 의해 견고성 (Rigidity)이 증가한 적혈구가 안정한 응집체의 형성을 잘하지 못하여 슬라이드시험에서 응집성이 감소하는 것으로 보인다. 글루타르알데하이드로 화학수정된 적혈구는 산소전달능력에 있어서 산소친화도 $(p_{50})$와 Hill상수 $(n_{50})$의 감소를 일으켜 산소전달가능 백분율의 감소를 보였다. 하지만 산소를 완전히 제거한 후 화학수정하였을때 산소친화도값의 증가를 보였다. 이러한 글루타르알데하이드 수정된 적혈구는 그 안정성이 뛰어나고 산소전달능력도 어느 정도 가지기 때문에 대체혈액이나 약물전달체계(Drug delivery system)로의 개발에 유리하다. 따라서 본 연구에서는 이러한 화학수정을 보다 효율적으로 할 수있는 연속반응기를 개발하였다. 글루타르알데하이드의 반응이 매우 빠르게 일어나는 것을 이용하여 Hollow fiber를 통한 적혈구의 이동시 글루타르알데하이드의 hollow fiber 내로의 확산에 의한 화학반응기를 설계하였다. 본 연구에서는 hollow fiber로서 소아용 신장투석기로 사용하고 있는 AM-03 Hemodialyzer를 이용하였다. 이 반응기는 연속반응이 가능해 대량생산에 유리하며 무균상태로의 조작이 가능해 임상적으로 사용할 적혈구의 개발에도 유리하다. 또한 기존의 방법에서 글루타르알데하이드 처리후 반응하지않은 글루타르알데하이드를 제거하기 위하여 원심분리와 재현탁의 반복을 통한 적혈구의 세척과정을 거치지 않게 설계할 수 있어 적혈구의 손상을 줄일 수 있다. 이 반응기를 통해 화학수정된 적혈구는 기존의 글루타르알데하이드 수정 적혈구와 같은 성질을 보였으며 산소전달능력은 보다 향상되었다.
적혈구를 대체혈액으로 개발함에 있어서 고려해야할 또 하나의 성질은 적혈구가 가지는 높은 deformality이다. 이는 적혈구가 자신보다 훨씬 작은 직경의 모세혈관을 쉽게 통과할 수 있게 하는 성질이다. 글루타르알데하이드 수정된 적혈구가 안정성은 있으나 너무 견고해 이러한 deformality는 감소한다. 이러한 견고성을 감소시키기 위하여 글루타르알데하이드 보다 mild한 crosslinker로 알려진 여러 화학물질들로 적혈구를 화학수정하였다. 이중 Divinylsulfone(DVS)에 의한 화학수정이 적혈구의 견고성을 크게 증가시키지 않으면서 삼투압에 따른 용혈을 감소시킴을 확인하였다. 그러나 글루타르알데하이드 보다 Hill 상수의 감소가 더 커 산소전달능력이 더 낮았다. 따라서 현재까지의 결과로는 글루타르알데하이드가 적혈구를 안정화 시킬 수 있는 가장 효과적인 물질이었다.
이상의 화학수정 방법들의 장단점을 보완하기 위해 적혈구를 두 화학물질로 수정하여, 안정하며 혈액형간 구분이 없는 적혈구를 얻을 수 있었다. 각 화학수정 별로 혈액형항원 항체간의 응집시험과 혈액형항체의 결합유무시험 등을 수행하여 화학수정이 혈액형항체와 항원 반응에의 영향을 살펴본 결과 글루타르알데하이드는 혈액형항원와 항체의 결합은 이루어 지나 적혈구가 견고해진 때문에 응집이 억제 되었고, 메톡시폴리에틸렌글리콜은 적혈구항원에 항체의 접근을 억제하여 응집이 감소함을 확인하였다. 이들 화학수정 적혈구들의 산소전달능력은 정상적혈구의 절반정도로 감소하였으나 기존의 대체혈액개발물질들에 비해 우수한 산소전달능력을 보였다. 이러한 산소전달능력을 좀 더 증가 시키기 위하여 Bezafibrate (BZF)라는 헤모글로빈의 산소친화도 조절물질을 사용하였다. 앞에서 기술한 화학수정 반응과정에 BZF를 최종 20 mM 농도로 첨가하여 산소전달능력이 크게 향상됨을 확인하였다. 이러한 효과는 반응이 끝난 후 첨가하여도 나타났다.
본 연구의 연구결과는 적혈구의 혈액형항원에 의한 응집성을 화학적인 방법으로 제거하는 최초의 기술로서 그 응용성이 크다. 헌혈된 혈액에서 분리된 적혈구를 수혈시 혈액형 구분없이 사용 가능하게하여 특정 혈액형의 부족문제와 적절히 수혈된 경우에도 나타날 수 있는 수혈 후 거부반응을 미리 제거하여 수혈부작용 문제를 해결할 수 있다. 또한 안정한 적혈구를 얻을 수 있어 저장기간을 연장할 수 있고 혈액의 효율적 관리에도 큰 역활을 하리라 기대된다. 본 연구에서 사용한 화학수정법은 모든 항원에의 적용이 가능해 특히 조직이식시의 거부반응을 없애는데도 그 활용이 기대된다.
