Understanding the conformational distribution of protein molecules is essential for comprehending their biological functions. Conventional structural determination techniques typically provide the average ensemble features, with limitations in measuring the heterogeneous conformational distributions within individual protein molecules. Especially, small-sized proteins are known to participate in biological responses by exhibiting a wide range of dynamic, and heterogeneous conformations rather than a single equilibrium structure. Therefore, to understand the functions of small proteins, experimental methods are required that can statistically visualize the heterogeneous conformational distributions that proteins can adopt. Here, we present an experimental method, "Multi-Tilt Nanoparticle-Aided Cryo-electron microscopy Sampling (MT-NACS)” to determine the conformational distribution of calmodulin (CaM) protein upon ligand binding and variations of salt concentrations. Due to the difficulty in obtaining enough contrast in cryo-electron microscopy images for small protein molecule, gold nanoparticles were utilized as contrast agents. By imaging CaM proteins labeled by two gold nanoparticles at multiple tilt angles and analyzing the projected positions of gold nanoparticles, we can extract the three-dimensional interparticle distance between two gold nanoparticles of CaM. By collecting sufficient images of gold nanoparticle-labeled CaM, the distributions of 3D interparticle distances of CaM were obtained.
First, we confirmed the feasibility of our method by comparing the results of MT-NACS experiments, which investigated structural changes induced by calcium ion binding and variations in salt concentration, with previous studies. Additionally, MT-NACS was utilized to track the structural changes upon binding of amyloid beta peptide to CaM, which has never been observed experimentally. We anticipate that this experimental work will offer an alternative platform for unraveling the functional flexibility of small protein molecules.
단백질 분자의 구조적 분포는 해당 분자의 생물학적 기능을 이해하는데 필수적이다. 기존의 단백질 구조적 정보를 파악하는 기법은 주로 평균적인 구조적 양상을 기술하며, 단일 단백질 분자의 다양한 구조적 양상을 측정하기 어려운 한계가 있다. 작은 크기의 단백질은 고정된 3차원 구조를 가지지 않고 다양한 구조적 양상을 보이면서 생체 반응에 관여한다고 알려져 있다. 따라서, 작은 단백질의 생물학적 기능을 근본적으로 이해하기 위해서는 이들이 가질 수 있는 다양한 구조 분포를 통계적으로 시각화 할 수 있는 실험적 방법이 필요하다. 본 연구에서는‘다각도 측정을 통한 금 나노입자 기반 저온 전자현미경 샘플링’이라는 새로운 실험적 방법을 제안하고, 이 방법을 활용하여 칼모듈린 단백질의 다양한 리간드 결합 및 다양한 샘플 환경 변화 전후의 통계적 구조 분포를 구하였다. 작은 분자량의 단백질은 전자 현미경 이미지에서의 원하는 해상도를 얻기 어렵기 때문에, 전자밀도가 큰 금 나노 입자를 활용하여 측정하였다. 분자 내 원하는 두 위치에 금 나노입자를 표지한 단백질의 이미지를 다양한 각도에서 측정한 후, 각각의 각도에서의 금 나노입자 위치 정보를 분석하여 두 나노입자 사이의 3차원 거리를 결정하였다. 이러한 이미지를 다수 측정하여 얻은 삼차원 거리값들을 활용하여 칼모듈린 단백질의 두 나노입자 간 거리 분포를 도출하였다.
우선, 기존에 보고되어 알고 있는 칼슘 이온 결합 전후 상태 및 염 농도 변화에 따른 칼모듈린 단백질의 구조적 변화에 대한 결과와의 비교를 통해 다각도 측정을 통한 금 나노입자 기반 저온 전자현미경 샘플링 방법의 타당성을 확인하였다. 또한, 해당 기법을 활용하여 아밀로이드 베타와의 결합으로 인한 칼모듈린 단백질의 구조적 변동을 실험적으로 관측하였다. 본 연구에서 제시한 실험적 방법이 작은 단백질 분자의 다양한 기능적 유연성을 파악하는 데 효과적인 기법으로 기여하기를 기대한다.
