Transforming growth factor $(TGF)-\beta 1$, belonging to the $TGF-\beta$ superfamily, is a multifunctional cytokine involved in the regulation of cell proliferation, differentiation, apoptosis, and extracellular matrix (ECM) regeneration. The clinical potential of $TGF-\beta 1$ in wound healing, bone and cartilage formation, and the treatment of autoimmune diseases has been recognized in numerous studies.
Functionally active ligand of recombinant human $TGF-\beta$ superfamily, produced primarily in Chinese hamster ovary (CHO) cells for clinical applications, are considered to be difficult-to express proteins because they undergo maturation process, signaling pathway, or endocytosis. The $TGF-\beta$ superfamily of cytokines consists of proteins with highly conserved mature domains but low prodomain sequence similarity. Extensive efforts have been made to enhance the production of the $TGF-\beta$ superfamily cytokines in CHO cells, but the properties of the $TGF-\beta$ superfamily of cytokines are highly variable, and any general strategy to enhance their production in CHO cells remains unavailable.
For most $TGF-\beta$ superfamily members, the precursor passes through the proprotein convertases (PCs) located trans-Golgi network (TGN), the functionally active dimeric mature domain is separated from the prodomain. However, for $TGF-\beta 1$, the prodomain still binds non-covalently to the mature domain after proteolytic cleavage by PCs and secreted as inactive latent complex. Therefore, understanding the properties of recombinant human $TGF-\beta 1$ ($rhTGF-\beta 1$) is essential for improving $rhTGF-\beta 1$ production in CHO cells. However, the properties of $rhTGF-\beta 1$ in CHO cells have not yet been well characterized.
To enhance the production of $rhTGF-\beta 1$ in CHO cells, $rhTGF-\beta 1$ was first characterized for endocytosis, signaling pathway, and overall maturation process. The mature $rhTGF-\beta 1$ used for clinical application was internalized into CHO cells and inhibited the growth of CHO cells in a dose-dependent manner. However, mature $rhTGF-\beta 1$ was mostly produced in the form of latent $rhTGF-\beta 1$ in cultures of recombinant CHO (rCHO) cells producing $rhTGF-\beta 1$ ($CHO-rhTGF-\beta 1$). The concentration of active mature $rhTGF-\beta 1$ in the culture supernatant of $CHO-rhTGF-\beta 1$ cells was not high enough to compromise yield. In addition, a significant amount of unprocessed precursors was produced by $CHO-rhTGF-\beta 1$ cells. Overexpression of PACEsol, a soluble form of furin, in $CHO-rhTGF-\beta 1$ cells was effective for the proteolytic cleavage of unprocessed precursors. The highest mature $rhTGF-\beta 1$ concentration was obtained with the PACEsol-expressing clone, which was approximately $45%$ higher than that of the parental clone ($P < 0.01$). Thus, a comprehensive understanding of the intrinsic properties of $rhTGF-\beta 1$ with respect to the overall maturation process, signaling pathway, and endocytosis is essential for effectively enhancing the production of mature $rhTGF-\beta 1$ in CHO cells.
Additionally, we explored chemical additives to increase specific productivity (qp) of mature $rhTGF-\beta 1$ in CHO cells. However, these chemical additives significantly inhibited cell growth, thereby preventing an increase in the yield of mature $rhTGF-\beta 1$ in $CHO-rhTGF-\beta 1$ cells. By effectively suppressing chemical-induced apoptosis through Bax and Bak double knockout engineering in $CHO-rhTGF-\beta 1$ cell line, the addition of the HDAC inhibitor (iHDAC) $MS-275$ increased the yield of mature $rhTGF-\beta 1$. Unlike $CHO-rhTGF-\beta 1$, the Bax/Bak-knockout clone consistently exhibited increased production of mature $rhTGF-\beta 1$ at various concentrations of $MS-275$. Bax/Bak-knockout clones showed a minimum $38%$ increase in mature $rhTGF-\beta 1$ yield induced by $MS-275$ ($P < 0.01$). Therefore, the combined use of chemical additives and Bax/Bak knockout engineering represents a synergistic strategy suitable for enhancing the production of challenging proteins like $rhTGF-\beta 1$.
In summary, understanding the intrinsic properties of $rhTGF-\beta 1$ and utilizing a combination of approaches, including anti-apoptotic engineering and chemical additives, can significantly enhance $rhTGF-\beta 1$ production in CHO cells, paving the way for therapeutic protein producing of $rhTGF-\beta 1$.
형질전환생장인자 $(TGF)-\beta$ superfamily에 포함되는 $TGF-\beta 1$은 다기능 사이토카인으로 세포 증식, 분화, apoptosis, extracellular matrix (ECM) 재생 조절에 관여한다. 치료용 단백질로써 TGF-β1은 상처 치유, 뼈와 연골 형성, 그리고 자가면역 질환 치료 분야에서 많이 연구되고 있다.
주로 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 생산되는 치료용 단백질 목적의 재조합 인간 $TGF-\beta$ superfamily의 활성 리간드는 성숙화 과정, 신호 전달 유도 또는 세포내이입의 문제를 겪기 때문에 발현이 어려운 단백질로 취급된다. $TGF-\beta$ superfamily 사이토카인들은 mature domain은 비슷한 구조를 가진 반면, prodomian의 서열 유사성은 낮다. 따라서 CHO 세포에서 $TGF-\beta$ superfamily 사이토카인들의 생산량을 향상시키기 위해 많은 노력이 기울여졌지만, $TGF-\beta$ superfamily 사이토카인들의 특성이 매우 다양하여 재조합 CHO 세포에서 그들의 생산량을 향상시키기 위한 일반적인 전략은 아직 없다.
대부분의 $TGF-\beta$ superfamily 구성원들은 전구체가 프로단백질 전환효소 (PCs)가 위치한 trans-Golgi network (TGN)을 통과하면서, 활성화된 dimeric mature domain이 prodomain으로부터 분리된다. 그러나 $TGF-\beta 1$의 경우, 전구체가 PC에 의해 단백 분해된 후에도 prodomain이 mature domian과 비공유 결합하여 비활성 상태의 latent complex로 분비되는 특성을 가진다. 따라서 CHO 세포에서 $rhTGF-\beta$의 생산량을 향상시키기 위해서는 이러한 $TGF-\beta-1$의 고유 특성을 이해하는 것이 중요하지만, CHO 세포에서 이에 대한 연구는 아직 부족하다.
CHO 세포에서 $rhTGF-\beta$의 생산을 향상시키기 위해, 우선적으로 $rhTGF-\beta 1$의 세포내이입, 신호 전달 및 전반적인 성숙 과정에 대한 특성을 정립하였다. 활성화된 mature $rhTGF-\beta 1$은 CHO세포에 세포내이입이 되었으며, 신호 전달 유도를 통해 mature $rhTGF-\beta$ 농도에 비례하여 CHO 세포의 성장을 억제했다. 그러나 실제 $CHO-rhTGF-\beta$ 세포의 배양 상등액에서, mature $rhTGF-\beta$의 농도는 세포의 성장을 방해하거나, 세포내이입에 의해 수율을 저하할 만큼 충분히 분비되지 않았으며, 대부분이 활성을 가지지 않은 latent $rhTGF-\beta 1$ 형태로 분비되었다. 추가로 $CHO-rhTGF-\beta 1$ 세포에서는 상당량의 가공되지 않은 전구체가 분비되었다. 따라서 효과적인 전구체의 단백 분해를 위해 $CHO-rhTGF-\beta 1$ 세포에서 furin의 수용체 형태인 PACEsol을 과발현하였다. 가장 높은 농도의 mature $rhTGF-\beta 1$을 생산한 PACEsol 과발현 클론은 부모 클론보다 mature $rhTGF-\beta 1$ 생산량이 약 $45%$ 높았다 ($P < 0.01$). 따라서 성숙 $rhTGF-\beta 1$의 전반적인 성숙 과정, 신호 전달 및 세포내이입과 관련된 $rhTGF-\beta 1$의 본질적인 특성을 종합적으로 이해함으로써 CHO 세포에서 mature $rhTGF-\beta 1$의 생산을 효과적으로 향상시켰다.
또한, 우리는 재조합 CHO 세포에서 단위 세포당 mature $rhTGF-\beta 1$의 생산성 (qp)을 높이기 위해 화학 첨가물을 탐색했다. 그러나 화학 첨가물들은 세포 성장을 현저하게 억제하여 $CHO-rhTGF-\beta 1$ 세포의 mature $rhTGF-\beta 1$ 생산량 증가를 방해했다. Bax와 Bak 이중 녹아웃 엔지니어링을 통해 화학 물질이 유도하는 apoptosis를 효과적으로 억제함으로써, 재조합 CHO 세포에서 HDAC 억제제 $MS-275$에 의해 mature $rhTGF-\beta 1$의 생산량이 증가되었다. $CHO-rhTGF-\beta 1$ 세포와 달리, Bax/Bak 녹아웃 클론은 다양한 농도의 $MS-275$에서 mature $rhTGF-\beta 1$의 일관된 생산량 증가를 보였다. 최종적으로, 모든 세 개의 Bax/Bak 녹아웃 클론들에서 성숙한 $rhTGF-\beta 1$ 생산량이 $MS-275$에 의해 최소 $38%$ 이상 증가하며 ($P < 0.01$), 화학 첨가물의 활용 및 생산세포주의 Bax 및 Bak 녹아웃 엔지니어링의 동시 적용이 $rhTGF-\beta 1$과 같은 발현이 어려운 단백질의 생산을 증진시키기에 적합한 전략임을 보여주었다.
요약하자면, 본 학위 논문에서는 재조합 CHO 세포에서 기존에 잘 알려져 있지 않던 인간 유래 mature $TGF-\beta 1$ 단백질 생산을 연구하였고, $TGF-\beta 1$의 고유한 특성에 대한 이해를 바탕으로 PACEsol 과발현을 통해 mature $TGF-\beta 1$의 생산을 향상시켰다. 또한, 화학 첨가물의 활용과 그 단점을 보완하는 anti-apoptotic 엔지니어링을 $rhTGF-\beta 1$생산 CHO 세포주에 동시 적용하는 전략으로 발현이 어려운 단백질인 $TGF-\beta 1$의 생산을 향상시켰다.
