Pertussis, also known as whooping cough, is a highly contagious respiratory disease transmitted directly between humans. Pertussis is caused by the bacterium Bordetella pertussis and can affect people of all ages, with serious or even deadly outcomes for babies under one year of age. The whole-cell pertussis (wP) vaccine developed in the late 1940s protected against pertussis and rapidly reduced incidence. However, adverse reactions such as febrile convulsions and , very rarely, hypotonic-hyporesponsive episodes were observed at a high frequency after administration of the wP vaccine, underlining the need for a safer pertussis vaccine.
Acellular pertussis (aP) vaccine composing thress components including such as pertussis toxin (PT), filamentous hemagglutinin (FHA), and pertactin (PRN) from B. pertussis, is safer and less reactogenic than the wP vaccine. However, due to difficulties in the manufacturing process of acellular pertussis vaccines, only two acellular pertussis vaccines are approved and sold.
The purpose of this study is to develop a manufacturing process that overcomes the major technical limitations of the PT, FHA, and PRN antigen manufacturing process. Three types of antigens can be obtained by Bodetella pertussis cell culture, PRN can be obtained from cell pellets and PT and FHA can be obtained from culture supernatant.
PRN, a non-fibrial outer membrane protein of Bordetella pertussis, is a limiting component of cell-free pertussis vaccine due to its low expression, so the study of PRN manufacturing process was conducted with the main goal of improving productivity. We compared the extraction of PRN from the cell membrane using urea with the commonly used heating method and found that more membrane proteins were extracted using the urea method. Through the study of various conditions, it was found that the cell pellet processing conditions, including freezing and thawing, substantially affect the PRN yield. Finally, a single cycle of rapid freezing of the cell pellet with slow thawing resulted in up to 5-fold higher PRN yields than conditions without freezing and thawing. We also explored urea treatment conditions and found the optimal conditions. After extraction, residual impurities were removed by sequential anion exchange, hydrophobic interaction, and gel filtration chromatography to obtain highly purified PRN antigen with a purity of more than 95%, thus establishing a PRN manufacturing process.
PT and FHA are expressed in relatively large amounts and are obtained from the culture supernatant. Due to its strong toxicity, PT must undergo a detoxification process after the purification process. Because only PT undergoes detoxification process, cross-contamination of PT and FHA may cause safety concerns during vaccine manufacturing. So it is necessary to completely separate PT and FHA, and conditions capable of completely separating the two antigens were established through optimization of affinity column chromatography conditions. The design of experiment(DoE) method was used to optimize the conditions, and a design space capable of stably isolating antigens was selected. Through sequential hydroxyapatite, hydrophobic interaction, and affinity chromatography processes, PT and FHA antigens with a purity of more than 95% were obtained.
Scale-up study was conducted up to 200 L scale and reproducible results are confirmed. Acellular pertussis vaccine for adults was prepared by mixing three types of PT, FHA, and PRN antigens produced from a 200 L scale with diphtheria toxoid and tetanus toxoid, and its safety and efficacy were confirmed through non-clinical and clinical studies.
In conclusion, an integrated acelluar pertussis vaccine purification process for three types of antigens from Bodetella pertussis culture was developed. The membrane protein extraction process using urea developed in this study may also serve as a reference for manufacture of other membrane proteins and the methodology for finding antigen separation using affinity chromatography can be applied to the production of a variety of proteins. In addition, this pertussis antigen manufacturing method will be applicable to the development of various combination vaccines based on acellular pertussis.
백일해는 사람 사이에 직접 전파되는 전염성이 강한 호흡기 질환이다. 백일해는 Bodertella pertussis라는 박테리아에 의해 발생하며 모든 연령대에 영향을 미칠 수 있으며, 1세 미만의 아기에게는 치명적인 결과를 초래할 수 있는 질병이다. 1940년대 후반에 개발된 전세포 백일해(Whole-cell pertussis, wP) 백신은 백일해를 예방하고 발생률을 빠르게 감소키셨다. 하지만 전세포 백일해 투여 후 이상반응이 높은 빈도로 관찰되어 보다 안전한 백신의 필요성이 강조되었다.
백일해 독소(Pertussis toxin, PT), 필라멘트성헤마클루타닌(Filamentous hemagglutinin, FHA), 퍼탁틴(Pertactin, PRN)과 같은 성분을 포함한 무세포 백일해 백신(acellular pertussis, aP)은 전세포 백일보다 더 안전한 백신이다. 다만, 무세포 백일해 백신 제조 공정의 어려움으로 2개의 무세포 백일해 백신만이 허가되어 판매되고 있다.
본 연구의 목적은 PT, FHA, PRN 3종의 항원에 제조 공정에서 주요한 기술적 한계를 극복한 제조 공정을 개발하는 것이다. 3종의 항원은 Bodetella pertussis 균의 배양을 통해 얻을 수 있으며, PRN은 세포 펠렛으로부터 PT, FHA는 배양 상청액으로부터 얻을 수 있었다.
Bordetella pertussis의 비섬유성 외막 단백질인 PRN은 발현양이 적기 때문에 무세포 백일해 백신의 제한 성분이므로 PRN 제조 공정 연구는 생산성 향상을 주요한 목표로 연구를 수행하였다. 생산성에 주요하게 영향을 미치는 공정은 세포막으로부터 PRN을 추출하는 공정이며, 일반적으로 사용되는 가열을 이용한 추출 방식과 우레아를 이용한 추출 방법을 비교 하였으며 우레아를 이용한 방식에서 더 많은 막 단백질이 추출되는 것을 확인하였다. 다양한 조건 연구를 통해 동결 및 해동을 포함한 세포 펠렛 처리 조건이 PRN 수율에 실질적으로 영향을 미치는 것으로 밝혔다. 최종적으로 느린 해동과 함께 세포 펠릿의 단일 주기의 급속 동결을 통해 동결 및 해동이 없는 조건보다 최대 5배 더 높은 PRN 수율을 확보할 수 있었다. 또한 요소 처리 조건에 대한 탐색도 진행하였으며, 최적 조건임을 밝혔다. 추출 이후에 순차적인 음이온 교환, 소수성 상호작용 및 겔 여과 크로마토그래피를 통해 잔류 불순물을 제거하여 순도 95% 이상의 고순도의 PRN 항원을 얻어 PRN 제조 공정을 확립하였다.
PT과 FHA은 비교적 많은 양이 발현되고 있는 항원으로 배양 상청액으로 부터 얻게 된다. PT은 강한 독성으로 인해 정제공정 이후에 무독화 공정을 거친다. PT만이 무독화 공정을 진행하므로 FHA에 PT의 교차 오염은 백신 제조 시의 안전성에 문제를 일으킬 수 있다. PT 항원과 FHA 항원을 완전하게 분리하는 것이 필요하며 친화성크로마토그래피의 조건 최적화를 통해 2개의 항원을 완벽히 분리할 수 있는 조건을 확립하였다. 조건 최적화에는 실험설계법을 활용하였으며 안정적으로 항원을 분리할 수 있는 디자인스페이스를 선정하였다. 순차적인 수산화 인회석, 소수성 상호작용 및 친화성 크로마토그래피 공정을 통해 순도 95% 이상의 PT, FHA 항원을 얻을 수 있었다.
확보된 항원에 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드를 혼합하여 성인용 무세포 백일해 백신을 제조 하였으며, 비임상, 임상 연구를 통해 안전성, 유효성이 적합함을 확인하였다.
결과적으로, 본 연구를 통해 Bodetella pertussis 배양으로부터 효과적으로 3종의 항원을 제조하는 방법을 개발하였다. 개발 과정에 사용된 막단백질 추출법이나 친화성크로마토그래피를 이용한 항원 분리 방법을 찾아내는 방법은 다양한 단백질 생산에 적용이 가능할 것 이다. 또한, 본 제조 방법을 통해 무세포 백일해 기반의 다양한 혼합 백신 개발에 활용이 가능할 것이다.
