For decades, the growing demands for therapeutic proteins have been emphasized the importance of enhancing the productivity of Chinese hamster ovary (CHO) cells. The addition of small molecules during recombinant CHO (rCHO) cell culture is a straightforward and effective strategy to achieve high levels of therapeutic protein production. Notably, small molecule epigenetic modulators like histone deacetylase inhibitor (iHDAC) and DNA methyltransferase inhibitor (iDNMT) have shown their potential in elevating therapeutic protein production in rCHO cell cultures. However, while the addition of a small number of iHDACs and iDNMTs is known to enhance productivity, the precise mechanisms remained incompletely elucidated, and they have shown drawbacks, such as a decrease of viable cell concentration. Thus, this study aims to identify novel efficient small molecule epigenetic modulators and elucidate their mechanisms in rCHO cell cultures. Additionally, to alleviate the decrease of viable cell concentration, a CRISPR/Cas9 knockout (KO) cell library was utilized for screening in addition of iHDAC condition and identified novel KO target genes.
Firstly, to identify small molecule epigenetic modulators that enhance recombinant protein expression in CHO cells, I examined eight histone deacetylase inhibitors (iHDACs) and six DNA methyltransferase inhibitors as chemical additives in rCHO cell cultures. Among these, a benzamide-based iHDAC, CI994, was the most effective in increasing monoclonal antibody (mAb) production. Despite suppressing cell growth, the addition of CI994 to mAb-expressing GSR cell cultures at $10 \mu M$ resulted in a 2.3-fold increase in maximum mAb concentration due to a 3.0-fold increase in specific mAb productivity ($q_P$). CI994 increased mRNA levels of mAb and histone H3 acetylation in GSR cells. In addition, chromatin immunoprecipitation-quantitative polymerase chain reaction analysis revealed that CI994 significantly increased the histone H3 acetylation level at the cytomegalovirus promoter driving mAb gene expression, indicating that chromatin remodeling in the promoter region results in enhanced mAb gene transcription and $q_P$. Similar beneficial effects of CI994 on mAb production were observed in other benzamide-based iHDACs (MS-275, Mocetinostat, Tucidinostat). Collectively, the findings indicate that benzamide-based iHDACs increases mAb production in rCHO cell cultures by chromatin remodeling resulting from acetylation of histones in the mAb gene promoter.
However, the addition of iHDACs has been found to decrease viable cell concentration in rCHO cell culture, thereby offsetting the potential enhancement of therapeutic protein concentration compared to enhanced qP. Thus, secondly, to mitigate the iHDAC-induced negative effect on viable cell concentration, a screening using a genome-wide CRISPR/Cas9 gene KO cell library in rCHO cells was performed under CI994 and identified 10 potential genes that could enhance viable cell concentration of rCHO cell cultures under CI994 treatment. Among these genes, Bcor was validated as a promising target for improving viable cell concentration without negatively affecting rCHO cell productivity in iHDAC-containing conditions. The KO of Bcor resulted in increased viable cell concentration as well as therapeutic protein concentration. These findings highlight the potential of screening using a gene KO cell library to identify relevant target genes for overcoming challenges in rCHO cell cultures. Particularly, the knockout of Bcor, as identified in this study, showcased its applicability in achieving higher levels of therapeutic protein productivity under addition of iHDAC conditions.
In conclusion, this study successfully identified novel small molecule epigenetic modulators that improve the productivity of therapeutic protein production in rCHO cell lines, and elucidated the underlying mechanism of productivity improvement of these small molecules. In addition, through screening with a genome-wide CRISPR/Cas9-based gene KO cell library, potential target genes were identified to mitigate the decrease in viable cell concentration induced by small molecule epigenetic modulators. Finally, through the KO of the gene Bcor, which was one of the genes identified through screening, a higher viable cell concentration was achieved compared to the control cells and also increase of therapeutic protein concentration was observed.
지난 수십 년간 치료용 단백질에 대한 수요 증가로 Chinese hamster ovary (CHO) 세포의 생산성 향상은 중요한 과제가 되었다. 재조합 CHO (rCHO) 세포 배양 중 소분자의 첨가는 간단하고 효과적으로 높은 수준의 치료용 단백질 생산에 도달할 수 있는 전략이다. 특히, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 (iHDAC)와 DNA 메틸전이효소 억제제 (iDNMT) 같은 후성유전 조절 소분자들은 rCHO 세포 배양 중 치료용 단백질 생산을 향상시키는 소분자로서 잠재력을 보여왔다. 다만 소수의 iHDACs와 iDNMTs의 첨가가 rCHO 세포 배양 중 치료용 단백질 생산을 향상시키는 사실만 알려졌을 뿐, 정확한 작용 메커니즘은 완전히 규명되지 않았으며, 후성유전 조절 소분자들의 첨가가 생존 세포 농도를 감소시키는 등의 단점도 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 효과적인 새로운 후성유전 조절 소분자를 발굴하고, 이들의 작용 메커니즘을 밝히는 것을 첫 번째 목표로 하였다. 그 다음 CRISPR/Cas9 녹아웃 세포 라이브러리를 활용하여 iHDAC 첨가 조건에서 라이브러리 스크리닝을 진행하여 생존 세포 농도 감소 현상을 완화할 수 있는 녹아웃 타겟 유전자를 발굴하는 것을 두 번째 목표로 하였다.
먼저, CHO 세포에서 재조합 단백질 발현을 증가시키는 후성유전 조절 소분자를 식별하기 위해 8가지 iHDACs와 6가지 iDNMT를 rCHO 세포 배양에서 첨가하였다. 이 중에서 벤자마이드 기반의 iHDAC 중 하나인 CI994가 단일클론항체 (mAb) 생산을 가장 효과적으로 증가시키는 것으로 나타났다. $10 \mu M$ 농도로 mAb 생산 rCHO (GSR) 세포주 배양에 첨가시 세포의 생장속도는 감소했지만, 특정 생산성 ($q_P$)이 3.0배 증가하였고, 그로 인하여 최대 mAb 농도는 2.3배 증가했다. CI994는 GSR 세포에서 mAb의 mRNA 수준 및 배양 세포의 아세틸화 히스톤 H3 단백질 수준을 증가시켰다. 또한 염색질 면역 침강 및 정량적 중합 연쇄반응 분석을 통해 CI994가 mAb 유전자 발현을 유도하는 사이토메갈로바이러스 프로모터 부위의 아세틸화 히스톤 H3 단백질의 수준을 유의하게 증가시킴을 확인하였다. 이는 프로모터 영역에서의 염색질 리모델링이 mAb 유전자의 전사 및 $q_P$을 향상시킨다는 것을 보여준다. CI994의 유사한 효과는 벤자마이드 기반의 다른 iHDAC들 (MS-275, mocetinostat, tucidinostat)에서도 관찰되었다. 종합적으로, 이 결과는 벤자마이드 기반의 iHDAC들이 mAb 유전자 프로모터의 아세틸화 히스톤 증가에 의한 염색질 리모델링으로 rCHO 세포 배양에서 mAb 생산을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
그러나 iHDAC의 첨가는 rCHO 세포 배양에서 생존 세포 농도를 감소시켜, 향상된 qP 대비 치료용 단백질 농도의 향상을 상쇄시킨다. 그렇기 때문에 둘째로, iHDAC의 첨가로 인한 생존 세포 농도 감소 문제를 완화하기 위해, 전장유전체 CRISPR/Cas9 기반의 유전자 녹아웃 세포 라이브러리를 사용하여 CI994 첨가 조건하에서 유전자 스크리닝을 수행했고, iHDAC가 첨가된 배양 조건하에서 rCHO 세포의 생존 세포 농도를 향상시킬 수 있는 잠재적인 10가지 유전자를 발굴했다. 이 중에서 Bcor 유전자가 CI994 첨가 조건에서 rCHO 세포 생산성에 부정적인 영향을 미치지 않고 생존 세포 농도를 향상시키는 타겟 유전자로 확인되었다. Bcor의 녹아웃은 생존 세포 농도와 치료용 단백질 농도의 증가로 이어졌다. 이러한 결과는 유전자 녹아웃 세포 라이브러리를 이용한 유전자 스크리닝을 통해서 rCHO 세포 배양 시 만날 수 있는 어려움에 대한 관련 녹아웃 대상 유전자를 발굴할 수 있음을 보였으며, 특별히 본 연구에서 발굴된 Bcor의 녹아웃은 iHDAC 첨가 조건에서 더 높은 수준의 치료용 단백질 생산성을 얻는데 사용될 수 있음을 보여주었다.
결론적으로 본 연구를 통해 재조합 CHO 세포주의 치료용 단백질 생산성을 향상시키는 새로운 후성유전 조절 소분자를 발굴하였고, 이러한 소분자들의 생산성 향상 메커니즘을 밝혔다. 또한 후성유전 조절 소분자에 의해 발생하는 생존 세포 농도 감소 현상을 해결할 수 있는 타겟 유전자를 전장유전체 CRISPR/Cas9 기반의 유전자 녹아웃 세포 라이브러리의 스크리닝을 이용해 발굴하였고, 실제로 생존 세포 농도 감소 현상을 완화하며 치료용 단백질 농도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
