A facultatively anaerobic bacterium producing an extracellular alkaline lipase was isolated from the soil collected near a sewage disposal plant and identified to be a strain of Proteus vulgaris. The lipase of P. vulgaris was purified by ammonium sulfate precipitation and CM-Sepharose chromatography. The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be 31 kDa by SDS-PAGE. This lipase was found to be an alkaline enzyme having maximum hydrolytic activity at pH 10, and yet it is fairly stable in a wide pH range from 5 to 11.
The gene for the enzyme was cloned in Escherichia coli. Sequence analysis showed an open reading frame of 861 bp coding for a polypeptide of 287 amino acid residues. The amino acid sequence of the lipase deduced from the nucleotide sequence of the gene has 46.3%, 41.5%, and 39.7% of sequence homolgies with the lipases from Pseudomonas fragi, P. aeruginosa, and P. glumae, respectively. Inspection of the sequence alignment with these lipases indicated that Ser79, Asp232, and His254 form a catalytic triad of the enzyme. This lipase is similar to group I lipases with respect to the molecular size and amino acid sequence. However, this enzyme is also similar to group II lipases including P. fluorescens and S. marcescens lipases in that it (i) does not contain an N-terminal signal sequence and (ii) it does not require any additional protein for active form. Therefore, P. vulgaris K80 lipase may be considered to be a new lipase with some properties similar to those of group I lipases and with some other characteristics to group II lipases.
An expression plasmid, pKLE carrying the lipase gene was constructed. The lipase content in E. coli cells harboring the plasmid pKLE estimated from the specific activity of E. coli cell extract was more than 22% of total soluble protein, 4000-fold higher than that of E. coli JM83/pKLB. The enzyme displayed a partial interfacial activation toward p-nitrophenyl butyrate, indicating that this enzyme is able to degrade both PNPB emulsions and monomeric PNPB. Partial interfacial activation is a new trait found only in a couple of other lipases. Comparison with P. glumae lipase, which X-ray crystal structure was reported, indicated that Tyr127-Ile139 segment of P. vulgaris lipase corresponds to the lid segment of P. glumae lipase. This segment may be involved in the interaction with PNPB emulsion, even though the mechanism might be different from the case of porcine pancreatic lipase, an example displaying typical interfacial activation.
알칼리 내성 리파제를 생산하는 통성혐기성 세균인 Proteus vulgaris K80 균을 하수처리시설 주변의 토양에서 분리한 후, 이 균으로부터 생산되는 리파제를 순수 분리하여 그 생화학적 특성을 살펴보았다. 리파제 K80의 분자량은 SDS전기영동상에서 31,000으로 밝혀졌고, pH 10에서 최적의 효소활성을 보였으며, pH 5에서 pH 11 까지의 광범위한 범위에서 안정성을 보였다.
리파제K80의 유전자를 대장균에서 클로닝한 후 염기배열을 조사 분석한 결과, 이 효소는 861개의 염기로 부터 판독되는 287개의 아미노산으로 이루어졌으며, Pseudomonas fragi, P. aeruginosa 그리고 P. glumae 가 생산하는 리파제와 각각 46.3%, 41.5% 그리고 39.7%의 유사성이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 이들 리파제와 아미노산 서열의 비교분석을 통해서 Ser79, Asp232 그리고 His254가 리파제K80의 활성부위의 triad를 구성하는 것으로 추정하게 되었다. 리파제K80 은 분자크기와 아미노산 서열등을 통해 볼때 그룹I 리파제와 유사하지만, N말단에 전형적인 세포외 분비 신호서열을 갖고 있지 않으며, 폴딩에 관여하는 chapheron을 요구하지 않는 점에 대해서 그룹II 리파제와 공통점을 갖는다.
리파제K80 의 대량생산을 위해서 대량생산용 벡터 pKLE를 개발하였다. pKLE를 갖고 있는 대장균을 배양하면서 IPTG를 처리한 결과 세포추출액중의 리파제의 활성이 500 U/ml로 증가하여 세포내 단백질 중에서 리파제가 차지하는 비중이 22% 이상으로 현저하게 증가되었다. 대량생산된 리파제는 양이온 교환 수지를 이용해서 간단히 분리되었으며, PNPB를 기질로 사용해서 리파제K80의 계면활성화를 조사한 결과, PNPB 에멀전과 PNPB모노머에 대해 모두 활성을 보이는 'partial' 계면활성화를 하는 것으로 판명되었다. X선 결정구조가 밝혀진 P. glumae 리파제와의 아미노산 서열을 비교한 결과 Tyr127-Ile139 부위가 리파제K80의 활성부위를 덮고 있는 'lid'로 작용하는 것으로 추정되었다. Tyr127-Ile139부위를 helical wheel로 구성해보면 소수성도( H)가 0.5인 amphiphatic -helix를 이루는 점에서 이부위가 lid로 작용하여 PNPB에멀전과의 상호작용에 관여한다는 사실을 추정할수 있다.
