The chalcone synthase(CHS), the key enzyme of the anthocyanin synthesis pathway, was studied to establish the system of gene screening as a model system. A potato cDNA was synthesized from mRNA extracted from in vitro microtuber in early tuberization stage. Degenerate oligonucleotides encoding conserved sequences of CHS gene in other plant were used for PCR and two independent partial length CHS cDNA clones were isolated. Finally, we have isolated a chalcone synthase gene 2(ST-CHS2) from potato by rapid amplification of cDNA ends PCR. CHS2 cDNA had high homology to tomato LET-CHS2(98%), petunia PHCHSJ(94%), potato ST-CHS1B(92%), petunia PHCHSA (92%), and LET-CHS1(90%) at the overall 389-amino acid level. Genomic hybridization analysis indicated that CHS genes of potato comprise a family of at least six individual members. To inhibit the synthesis of anthocyanin, we constructed vectors of pBI/CH1-Asand pBI/CH2-S containing antisense and sense cDNA encoding potato CHS under the control of CaMV 35S promoter, and a nos-nptII marker gene. Potato leaf disc cultured in vitro were transformed by the Agrobacterium strainLBA4404 containing pBI/CH1-AS and pBI/CH2-S from three varieties of potatoes (cv.Red Pontiac, Desiree, Superior). At stage of selection for transformant, 50 mg/L kanamycin medium was effectively used without reducing regeneration capability of transformed potato. The polymerase chain reaction (PCR), amplifying the 700bp neomycin phospho transferase (NPTII) sequences with NPTII primer, proved to be a routine analytical tool for successfully analyzing the potato transformants for the presence of foreign gene. Red Pontiac exhibit a characteristic pattern of red pigmentation on the tuber skin. The extraction and quantitative analysis of anthocyanin from transgenic microtubers showed that red skin color of microtuber was decreased. The relative absorbance at 513nm decreased in the all transgenic lines by 55%-25%. Transgenic line No.8(CS1RP8) is the most decreased line in the contents of anthocyanin among 7 transgenic Red Pontiac lines. RT-PCR analysis demonstrated that ST-CHS2 gene is expressed mainly in stem and developing tuber of potato. The ST-CHS1 and ST-CHS2 genes of potato are mainly expressed in skin, but not in cortex and pith of tuber. To investigate the relation of tuberization process and the expression of CHS genes, we performed RT-PCR analysis from different period of tuber induction. ST-CHS2 gene is constantly expressed during tuberization process and ST-CHS1 genes are negatively correlated with the process of microtuberization. The expression studies of potato CHS genes with regard to the effect of plant growth regulators, such as 2mM of CCC or 10μM methyl-jasmonic acid or 1μM of $GA_3$, were analyzed by RT-PCR. The total RNA was amplified with CS24 and PCR anchor primer for the detection of ST-CHS1 genes and with CS18 and PCR anchor primer for detection of ST-CHS 2 gene. CCC, a plant growth retardant, induced both CHS1 and 2 genes highly. However, the genes were only weakly induced by Me-JA and $GA_3$ during tuberization process. During shoot culture, we treated SA, Me-JA, and wounding in MS medium at a different period, such as 0, 12, 24, 48 hrs. Me-JA induced both CHS genes strongly within 12-48hrs, but SA and wounding did not. It is interesting that in transgenic lines, the more inhibition of anthocyanin pigment in tuber skin occurred, the little is CHS transcripts detected. And if we introduced one gene with a sense or antisense orientation, then other gene is a also consequently inhibited. To detect the transcripts of mRNA as a result of introduced gene only, we used CS12AS primer and PCR anchor primer. A very high level of 0.7 kb size transcripts is detected in line 6 and 10, but not in line 8, which has the most reduced skin color. In sense suppression, the results are the same. Me-JA induced CHS genes in transgenic lines, but line 3 and line 8,which has the most reduced skin color, showed no detectable induced signal.
감자 유래의 chalcone synthase 유전자를 클로닝하고 이의 발현과 안토시아닌 색소의 antisense 저해에 관한 연구를 위하여 감자의 초기발생 기내소괴경으로 부터 5'/3' RACE 실험을 수행하였고 감자 CHS 유전자의 antisense Ti벡터를 만들어 형질전환 감자를 만들고 이의 저해를 살펴보고자 다음의 실험들을 수행하였다.
5'/3'RACE 방법을 이용하여 감자의 초기발생단계의 소괴경으로 부터 각기 다른 세가지의 CHS유전자 (ST-CHS1A/B,2)을 클로닝하였다. 또한 감자 CHS 유전자 특이적인 primer를 사용한 RT-PCR을 이용하여 조직특이 발현여부를 검증하였다. 클론된 감자유전자의 서열을 토마토의 것과 비교하여 CHS 유전자의 진화하여 온 자취를 유추해 볼 수 있었다. 감자CHS2 cDNA는 토마토 LET-CHS2유전자와 98%, 페튜니아PHCHSJ와 94%, 감자ST-CHS1B 와 92%, 페튜니아PHCHSA와 92%, 그리고 토마토 LET-CHS1와 90% 등 총 389 아미노산 수준에서 상동성을 갖는다. Genomic 유전자hybridization 분석에서 감자의 CHS 유전자는 적어도 6개이상의 multigene family 로 구성됨을 알 수 있었다. 안토시아닌 색소의 합성을 저해하기 위한 Ti-벡터를 만들었다. 이 벡터는 CaMV35S 프로모터를 가지고 있으며 선발표지 유전자로써 NPTII 유전자를 가지고 도입유전자의 방향에 따라 pBI/CH-1AS, pBI/CH-2-S 등의 CHS유전자에 대한 antisense 및 sense 저해를 일으킬 수 있도록 고안하였다. 레드폰티악, 데지레, 수미등의 품종으로 부터 pBI/CH1-AS 와 pBI/CH2-S를 함유하는 아그로박테리움에 의하여 조직배양중인 잎절편에 형질전환시켰다. 감자표피의 붉은색이 레드폰티악 품종에서 안토시아닌의 합성에 의한 것인데 형질전환된 감자로부터 기내소괴경을 형성, 안토시아닌을 측정한 결과 기내소괴경의 표피색이 옅어졌음을 알 수 있었다. 512nm파장의 상대적인 흡광도를 비교한 결과 모든 형질전환 레드폰티악 선발체에서 55%-25%의 감소치를 나타내었다.
RT-PCR 분석결과 ST-CHS1 와 ST-CHS2 유전자는 기내배양중인 감자의 줄기와 발생초기단계의 소괴경에서 많은 발현을 볼 수 있었다. 또한 감자괴경의 부위별 실험에서 표피부위에서 가장 많이 발현되었다. 소괴경의 형성과정과 CHS유전자의 발현과의 관계를 RT-PCR을 이용하여 조사하였는데 일주일 동안의 초기단계의 소괴경 형성시에 ST-CHS2 유전자는 계속 일정한 양이 발현되고 있었으며 반면 ST-CHS1 유전자는 역의 상관관계를 갖고 있었음을 알 수 있었다.
식물 생장촉진제들에 의한 효과들에 관한 실험을 위해 2mM의CCC, 10μM의 Me-JA, 1μM의 $GA_3$ 의 처리결과 다음과 같다. 총 ST-CHS1의 발현양을 특이적으로 분석하기 위하여 CS24 primer를 ST-CHS2 유전자를 특이적으로 분석하기 위하여 CS18과 PCR anchor primer를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 생장저해제인 CCC가 CHS1과 CHS2 유전자를 강하게 유도하였다. 그러나 Me-JA과 $GA_3$는 소괴경형성동안에 처리에 의해 약하게 CHS유전자를 유도하였다. 기내 줄기배양시 역시 SA, Me-JA wounding 처리를 각기 다른 시간별로 처리하여 0, 12, 24, 48시간후에 발현정도를 살펴보았는데 Me-JA가 강하게 CHS1,2 유전자 모두를 12-48 시간내에 유도하였으나 SA와 wounding은 그러하지 못하였다. 형질전환체의 감자기내소괴경 안토시아닌 색소의 합성이 저해가 많이 일어난 선발체일수록 CHS 발현양이 적었다. 그리고 CHS1유전자를 sense나 antisense 방향으로 도입하였어도 CHS1 유전자뿐 만 아니라 같은 양상으로 CHS2 유전자도 발현됨을 알 수 있었다. 도입된 유전자의 발현만에 의한 발현양을 조사하기 위하여 CS12AS primer 와 PCR anchor primer를 사용하여 형질전환체로부터 RT-PCR을 수행하여 6번과 10번 선발체에서 0.7kb의 강한 발현을 알 수 있었으나 가장 안토시아닌 색소 합성이 저해된 8번 선발체의 경우에는 거의 발현양을 볼 수 없었다. 역시 sense suppression 의 경우에도 같은 결과를 보였다. Me-JA 는 형질전환 감자에서도 CHS 유전자를 강하게 유도하였는데 역시 가장 안토시아닌 색소 합성이 저해된 8번과 3번 선발체의 경우에는 거의 발현양을 볼 수 없었다.
