Methylobacterium organophilum NCIB 11278, a pink pigmented facultative methylotroph, accumulated 59% (w/w) by content with PHB in potassium-limited conditions from methanol as a sole carbon source, and 33% PHB in nitrogen-limited conditions. From the stoichiometry of the metabolic pathways it was found that surplus energy (ATP) must be produced to meet the NADH requirement for PHB synthesis in M. organophilum during growth on methanol. This was confirmed by measuring the intracellular ATP level during PHB synthesis. The intracellualr ATP level was increased from 0.190 to 0.390 μmoles ATP/g Xr (real biomass) in nitrogen limitation, whereas no significant increase occurred in potassium limitation known to have a high ATP requirement for active transport. The intracellular ATP level in potassium limitation was 0.183 - 0.185 μmoles ATP/g Xr, which was similar to 0.152 - 0.186 μmoles ATP/g Xr determined in non-limited conditions. This suggested that the high PHB content in potassium limitation was attributed to the maintenance of an energy balance through the dissipation of surplus energy (ATP). This was confirmed by the demonstration that the PHB content in nitrogen-limitation was also enhanced from 32.4% to 59% by the addition of 5mM 2,4-dinitrophenol which uncoupled the process of ATP synthesis from respiration.
Mass production of Poly(β-hydroxybutyrate) (PHB) from Methylobacterium organophilum under potassium-limited condition was carried out by using a microcomputer-aided automatic fed-batch culture system. The concentration of methanol was kept within the range of 2 - 3 g/l which did not show any inhibitory effect on cell growth. The PHB accumulation was stimulated when the potassium concentration in the culture broth fell below 25 mg/l. After 70 hours of cultivation, the concentrations of cell mass and PHB were obtained to be 250 g/l and 130 g/l, respectively, which corresponded to a volumetric productivity of 1.8 - 2.0 g-PHB/l/hr. PHB contents ranged from 52% to 56% of dry cell weight with a yield factor ($Y_{P/S}$) of 0.19 g-PHB/g-methanol.
Mass production of copolyester consisting of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyvalerate [P(3HB-co-3HV)] by automatic fed-batch culture of Methylobacterium organophilum was also investigated using methanol (main carbon source) and valerate (precursor). Among the six nutrients ($NH_4^+$, $K^+$, $Mg^{2+}$, $SO_4^{2-}$, $PO_4^{2-}$ and dissolved oxygen) tested, it was found that the synthesis of P(3HB-co-3HV) was most favored under the limitation of potassium. The optimal feeding ratio of methanol and valerate for mass production was found to be 10 : 1 (vol/vol). Under the optimized conditions, P(3HB-co-3HV) was accumulated as high as 99 g/l with a 3HV fraction of 11.0 mol% after 78 hours of cultivation. The maximum copolyester content was 42% of dry cell weight.
분홍색 색소를 갖는 facultative methylotroph 인 Methylobacterium organophilum NCIB 11278 를 이용하여 ammonia, potassium, magnesium, phosphate, sulfate, 용존 산소 등의 영양원 제한 조건하에서 메탄올로부터 균체내의 PHB 축적 양을 조사하였다. 질소원인 ammonia 제한 조건하에서는 건조균체 중량의 33%에 해당하는 PHB가 축적된 반면에 potassium 제한 조건하에서는 질소원 제한 경우의 2배에 해당하는 59%의 PHB 함량을 얻을 수 있었다. 또한, 메탄올로부터의 PHB 합성에 관한 M. organophilum의 대사경로로 부터 PHB 합성에 필요한 NADH를 공급하기 위해서는 상당양의 잉여 에너지 (ATP)가 발생함을 대사분석을 통하여 알 수 있었다. 그리고, 이것은 PHB 축적 과정중의 세포내 ATP 양의 측정을 통하여 확인할 수 있었다. 질소원 제한 조건하에서는 PHB 합성시 수반되는 잉여 ATP에 의해 세포내 ATP 양이 0.190 μmoles ATP/g Xr(실 균체량)에서 0.390 μmoles ATP/g Xr로 증가하였으나 potassium 제한 조건 하에서는 모든 영양원이 충분히 공급되는 경우의 세포내 ATP 양 (0.152 - 0.186 μmoles ATP/g Xr)과 유사한 0.183 - 0.185 μmoles ATP/g Xr의 세포내 ATP 양을 유지하였다. 이것은 potassium 제한 조건하에서 배지중의 미량 potassium을 세포내로 흡수하기 위하여 많은 양의 에너지가 소비되기 때문으로 추정된다. 따라서 potassium 제한시에 얻어지는 높은 PHB 함량은 PHB 합성시 발생하는 잉여 에너지의 소모에 의한 세포내 에너지 균형의 유지 결과라고 제안되었다. 이 제안은 2,4-dinitrophenol이라는 energy uncoupler를 사용하여 PHB 합성 기간중의 세포내의 잉여에너지를 인위적으로 소모시키도록 함으로써 질소원 제한 조건하에서도 59%의 PHB 함량을얻음으로써 확인할 수 있었다.
컴퓨터에 의해 제어되는 자동 유가식 배양을 통하여 potassium 제한 조건하에서의 PHB 고농도 생산을 수행하였다. 배지내의 메탄올 농도는 컴퓨터 제어에 의해 세포 생육에 적합한 2 - 3 g/l의 범위로 유지하였다. 배양액 내의 potassium 농도가 세포생육에 의해 25 mg/l 이하로 감소되면서 PHB 축적이 촉진되기 시작하였다. 70시간 배양에 의해 250 g/l의 균체량과 130 g/l의 PHB 를 얻을 수 있었고 이때의 PHB 생산성은 1.8 - 2.0 g-PHB/l/hr 이었다. 균체내 PHB 함량은 52 - 56% 이고 기질인 메탄올에 대한 수율은 0.19 g-PHB/g-methanol 이었다.
자동 유가식 배양을 통하여 3-hydroxybutyrate와 3-hydroxyvalerate로 이루어진 공중합체인 P(3HB-co-3HV)의 대량생산도 수행하였다. 탄소원으로 주 기질인 메탄올과 보조 기질인 valerate를 사용하였다. 공중합체의 3-hydroxyvalerate 단위체는 보조기질인 valerate로부터 생성되었다. Ammonia, potassium, magnesium, phosphate, sulfate, 용존 산소 등의 영양원 제한 조건하에서 P(3HB-co-3HV)의 축적정도를 조사하였고 그 결과, PHB 에서와 마찬가지로 potassium 제한 조건하에서 50%로 가장 높은 건조 균체내 P(3HB-co-3HV) 함량을 보였다. P(3HB-co-3HV) 생산에 적합한 주 기질과 보조 기질의 공급비율은 10 : 1 (vol/vol) 이었다. 최적화된 P(3HB-co-3HV) 생산 조건하에서 3HV 분율이 11 mol % 인 P(3HB-co-3HV)를 78 시간 배양을 통하여 99 g/l 까지 생산할 수 있었다. 이때의 건조 균체내의 공중합체 함량은 42% 이었다.
