The complete nucleotide sequence and genomic organization of human papillomavirus type 59 DNA isolated from vulvar intraepithelial neoplasia was determined. It consists of 7896 nucleotides. A comparative analysis of HPV59 with other sequenced HPVs revealed that genetic features of HPV59 are similar to those of other mucosal HPVs. This virus is most closely related to both HPV18 and 39 (60% identical nucleotide). Using distance matrix phylogenetic analysis, we compared the full L1 ORF of HPV59, 45 other HPV types, 2 subtypes, and 9 animal papillomaviruses. The resulting trees include virtually identical major branches to previous studies; however, they distinctly show subgrouping of all "high risk" HPVs, including HPV 59, into two minor branches. Phylogenetic analysis of the L2 ORF, a putative determinant of tissue specificity, was also performed, revealing identical "high risk" minor branches. Furthermore, the L2 motif thr-thr-pro-ala-val/ile-leu/ile-asp/asn-val/lie, an extension of a previously reported mucosal motif, is highly conserved and found exclusively in all HPV types which have been reported in mucosal lesions.
cis-regulatory element of the HPV 59 URR are identified by using CAT (chloramphenicol acetyl transferase) assay of deletion mutants and EMSA (electrophoresis mobility shift assay) of cis-elements for cellular transcribing factor, which are capable of independent enhancing activity. these results suggested that the structural organization of HPV59 E6 promoter is subdivided into three parts : distal (nt 7149 to 7493), central region (nt 7493 to 7742), and proximal region (nt 7742 to 48). In these subregions, the 249 bp (nt 7493 to 7742) of the central region plays an important role as the enhancer element for the maximal transcription of the E6 promoter. It also found that the HPV59 E2 transactivator can repress the transcription of the E6 promoter via inhibiting the formation of initiation complex. When the cellular factor binding to the HPV59 URR is examined with HeLa nuclear extract, these results demonstrated that transcription factors AP1, OCT1, and unidentified cellular factors can act as the trans-activator for the E6 promoter. In addition, transcription factors OCT1, YY1 (?), and SP1 can bind to the distal or proximal region of the E6 promoter. On contrary to the HPV18 E6 promoter, the putative GRE motif (nt 7843) of HPV59 URR did not act as the transcriptional enhancer of the E6 promoter.
To test the transforming activities of HPV-59 DNA and its gene products, several plasmids expressing HPV-59 ORFs are constructed. When these DNAs were transferred into mouse C127 cells, these results suggested that all three ORFs were independently able to transform C127 cells in the presence of G418, although the full length HPV-59 DNAs failed to induce the foci forming activity. The E7 ORF showed the strongest transforming activity and the E5 ORF exhibited the weakest transforming activity. Cell lines transformed by E5, E6, and E7 ORFs are established by using cloning cylinder. The cell lines transformed by HPV59 ORFs can grow anchorage-independently. The presence of HPV59 ORF DNAs is conformed by PCR and southern blot analysis in HPV59 ORFs-transformed cell lines.
To identify the function of p53 in the early gene expression of HPV-59, the transcriptional activity of HPV59 E6 promoter are analyzed by using CAT as a reporter gene in C33A cells. Wild-type p53, but not mutant p53, inhibit the transcription of the HPV59 E6 promoter. The transcriptional repression by wild type p53 is overcome by increasing the expression of the HPV59 E6 oncoprotein. cis-regulatory elements related to the repression by p53 can not be detected in the HPV59 URR, when deletion mutants of HPV59 URR are transfected with wild-type p53. Furthermore, wild-type p53 can not bind to the putative consensus sequences (nt 26, 75% identical nucleotides compared with consensus sequences) in the proximal region of E6 promoter. Therefore, it suggested that the transcriptional repression of HPV59 E6 promoter by wild-type p53 is mediated by inhibiting the formation of transcriptional initiation complex via a interaction with TBP.
본 연구에서 인 파필로마 바이러스 59 (HPV 59) DNA를 자궁암 조직으로부터 추출하여 전체 염기서열과 게놈의 구성을 밝혔다. 그 결과 HPV 59의 게놈은 7896 염기서열로 구성되어 있음을 알 수 있다. HPV 59를 다른 HPV들과 비교 분석하여 보면, 이 바이러스는 점막형 HPV들과 매우 유사한 유전학적 특성을 가졌다. 특히, 이 바이러스는 HPV 18 과 HPV 39 (60% 동일 염기서열)들과 가장 유사하다. HPV 59 L1 유전자의 계통분류학적인 분석을 하여 보면, HPV 59는 high-risk HPV 그룹에 속한다. 또한, HPV 59 L2 유전자에는 점막형 HPV들에게 중요한 점막형 인자(thr-thr-pro-ala-val/ile-leu/ile-asp/asn -val/ile)가 상당히 잘 보존되어 존재하며, L2 유전자의 계통 분류 역시 이들은 high-risk HPV에 포함되는 것을 알 수 있다.
본 연구에서는 순차적 돌연변이와 단백질의 DNA 결합 분석법을 이용하여, HPV 59 유전자 조절 부위(URR)의 전사 조절 cis 인자들과 세포성 trans 인자들을 분석하였다. HPV 59 URR의 순차적 돌연변이체들의 분석 결과 HPV 59 E6 프로모터는 3개의 조절 부위 distal 부위 (nt 7149부터 7493), central 부위 ( nt 7493부터 7742) 그리고 proximal 부위 (nt 7742부터 48)로 나뉘어 졌다. 이들 부위들 중에서 central부위의 249 bp가 E6 프로모터의 전사조절에 가장 중요한 enhancer로서 작용하였다. HPV 59 E2 전사인자는 세포성 전사인자인 SP1이나 TFIID의 결합을 방해하여 E6 프로모터의 전사를 억제하였다. 이러한 바이러스성 전사인자 이외에 E6 프로모터의 전사기작에 영향을 주는 세포성 인자를 단백질의 DNA 결합 분석법을 이용하여 조사하였다. 그 결과, 세포성 전사인자 AP1, OCT1, YY1 과 SP1 등이 E6 프로모터 부위에 결합할 수 있다는 사실을 증명하였다. 그러나, HPV 18의 E6 프로모터와는 반대로 GRE element는 HPV 59 E6 프로모터의 전사기작에 영향을 주지 못했다.
HPV 59와 그것의 유전자들의 형질전환 능력을 조사하기 위하여, HPV 59 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하였다. 그리고 이들을 쥐의 C127 세포에 주입시켰을 때, HPV 59의 세 가지 유전자들은 각각 독립적으로 쥐 C127 세포를 형질전환 시킬 수 있었다. 그러나, HPV 59 게놈만으로는 쥐 C127 세포를 형질전환 시키지 못했다. 이러한 HPV 59의 형질전환 능력은 E7 유전자에서 가장 강하게 나타났고, E5 유전자는 가장 약한 형질전환 능력을 보였다. 이렇게 HPV 59 유전자에 의해 형질전환 되어진 세포들은 순수 분리하였으며, 이들을 연성 agar 배지에서 배양하여 형질전환된 세포들의 부착성 성장이 없어지는 것을 확인하였다. 그리고, 순수 분리되어진 형질전환 세포내에 HPV 59 유전자가 존재하는 것을 PCR 및 southern blot 분석으로 증명하였다.
HPV 59 초기 유전자들의 발현에 미치는 p53의 역할을 조사하기 위하여, CAT 분석법을 사용하여 E6 프로모터의 전사 조절을 조사하였다. 그 결과 E6 프로모터의 전사는 p53에 의해서 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 p53의 전사 억제는 HPV E6 암 단백질을 증가시켰을 때 나타나지 않았다. 또한, p53을 E6 프로모터의 순차적 돌연변이체들과 함께 C33A 세포에 주입시켰을 때 E6 프로모터의 전사활성은 억제되었다. 그러므로 E6 프로모터에는 p53과 관련된 cis 인자가 존재하지 않음을 알 수 있었다. 이러한 사실을 더욱 증명하기 위하여, p53이 p53 결합 부위로 추정되는 E6 프로모터 근접부위에 결합할 수 있는지 조사하였다. 그 결과, p53은 E6 프로모터에 결합하지 않는다는 사실로 미루어, p53의 전사 억제는 p53이 TBP와 직접 상호작용 하여 전사개시체들의 형성을 방해함으로서 일어나는 것을 알 수 있다.
