An extracellular vesicle (EV), a vesicle with a lipid bilayer membrane structure, contains comprehensive information such as nucleic acids and proteins of the cell of its origin. In particular, EVs can protect parental information from degrading enzymes in the blood and contain membrane proteins because of the property of the lipid bilayer, differentiating it from conventional biomarkers. In addition, cancer cells actively release more EVs than normal cells due to the enhanced metabolic processes. Therefore, EVs are emerging as an important biomaterial for the discovery of novel cancer biomarkers or personalized diagnoses such as companion diagnostics. To carry out EV studies, ultracentrifuge or polymer precipitation methods have been developed. However, it was difficult to obtain high-purity EVs from the blood due to the presence of contaminants such as low-density lipoproteins (LDLs) and albumin. In this dissertation, a size-exclusion chromatography (SEC)-based EV separation method was developed to increase the purity of EVs by using blood cancer plasma (acute myelogenous leukemia). The size distribution and characteristics of EVs, LDLs, and soluble proteins in the plasma were confirmed by varying the designing parameters such as resin pore size, sequential dual stacking, and the ratio of beds and the optimal parameters were selected by observing the properties of contaminants. The separated EVs showed higher purity than conventional SEC and polymer precipitation methods, and this effect was also appeared in solid cancer plasma (non-small cell lung cancer). For the application of companion diagnosis, EV-derived DNA was analyzed to detect the epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations. As the isolated nano-sized EVs appeared to contain highly pure ctDNA, comparable diagnostic results to direct analysis of plasma were obtained. Furthermore, to overcome the limitations of the conventional analytical methods based on nucleic acid amplification, the novel method based on the affinity of EGFR-gefitinib and surface-enhanced Raman scattering (SERS) were developed for direct analysis of EGFR status. The developed protein analysis method was able to distinguish EGFR status according to WT, primary (19 deletion) and secondary mutations (19 deletion/T790M), and also to be analyzed in EV of 100 μl plasma. In conclusion, in this study, the developed dual SEC allows the isolation of highly pure EVs in a simple and rapid manner from plasma., In addition, the separated EVs reflected the cancer EGFR mutations when using non-small cell lung cancer plasma. And the developed EGFR analytical method could reflect tumor EGFR status via EV proteins. These results will aid in the investigation of EV-based novel biomarkers and at the same time, open the possibility of utilizing EV proteins as a diagnostic tool in predicting the response of target drugs in the future.
세포외소포는 세포의 대사과정에서 모세포의 단백질과 핵산 등 종합적인 정보를 포함해 세포 외로 방출되는 이중 지질막 구조의 소포체이다. 특히, 세포외소포의 이중 지질막 구조는 혈액 내 분해효소로부터 모세포의 정보를 보호하고 막 단백질을 포함할 수 있어 기존 바이오 마커와 차별화되는 특성을 가지고 있다. 또한 활발한 대사과정을 가진 암세포는 정상세포보다 많은 세포외소포를 방출한다. 따라서 새로운 암 바이오 마커 발굴 및 동반진단과 같은 맞춤형 치료 연구에서 세포외소포는 중요한 생체 물질로 떠오르고 있다. 이러한 연구를 수행하기 위해 세포외소포의 물리화학적 특성을 이용한 초고속원심법 및 고분자 침전법과 같은 다양한 분리법이 개발되었다. 그러나 혈액 내에는 세포외소포와 특성이 겹치는 저밀도지질단백질 및 알부민이 함께 포함되어 높은 순도의 세포외소포를 얻는데 어려움이 있었다. 본 학위 논문에서는 이를 해결하기 위해 급성 골수성 백혈병 환자의 혈장을 이용하여 크기배제 크로마토그래피 기반 분리법을 개발하였다. 이를 위해 혈장 내 세포외소포, 저밀도지질단백질, 알부민의 크기 분포와 특성을 확인하고 컬럼 비드의 기공 조절, 연속적인 이중 적층, 비율 최적화를 통해 기존 분리법보다 순도 높은 세포외소포를 분리할 수 있었다. 개발된 분리법은 비소세포폐암 환자 혈장에서도 같은 효과가 나타났으며 비소세포폐암 동반진단 적용을 위해 표피 성장인자 수용체 돌연변이의 디옥시리보핵산을 분석하였다. 그 결과, 혈장 전체를 이용한 진단결과와 동일한 민감도와 특이도를 나타내는 세포외소포를 분리할 수 있었다. 또한 기존 핵산 증폭을 기반한 돌연변이 분석법 한계를 극복하고자 세포외소포에 존재하는 표피 성장인자 수용체를 직접적으로 분석하는 방법을 개발하였다. 이를 위해 표피 성장인자 수용체와 타이로신 키나아제 억제제간의 친화도 및 표면증강 라만 분광법에 기반한 분석법을 개발하였다. 개발된 분석법은 양생형, 1차 돌연변이 (엑손19 삭제), 2차 돌연변이 (엑손19 삭제 및 T790M)에 따라 표피 성장인자 수용체를 구분할 수 있었다. 또한 100마이크로 환자 혈장의 세포외소포를 이용하여도 분석이 가능함을 확인하였다. 종합적으로, 본 연구에서는 혈액 및 고형암 환자의 혈장에서 세포외소포를 고순도로 분리하는 이중 크기배제 크로마토그래피법을 개발하였으며 분리된 비소세포폐암 세포외소포는 혈장 내 암 돌연변이 정보를 반영하였다. 더 나아가 세포외소포 막 단백질인 표피 성장인자 수용체를 직접적으로 이용하여 암 표피 성장인자 수용체 상태를 확인할 수 있는 새로운 분석법을 개발하였다. 이는 향후 혈액 세포외소포를 기반한 바이오마커 발굴 및 표적 단백질에 대한 약제의 반응성을 확인하는 분석법으로의 적용이 기대된다.
