Using proteome analysis and carbon source diversification strategy, high performance Mannheimia succiniciproducens strains producing succinic acid have been developed through this study. Monitoring cellular and metabolic status by proteome analysis in several different conditions offered many clues to improve succinic acid production. The proteome information gives directions for further enhancement in succinic acid production in the aspect of productivity and yield. Hence, sucrose has been used to achieve succinic acid production with reduced pyruvate formation. However, the discrepancy between the fermentation result and the deduced hypothesis from genome sequence leaded to identify sucrose utilization system in detail in M. succiniciproducens. Based on the identification information, productivity-enhanced strain was developed aided with adaptive evolution. Cellular and metabolic status was also examined by using proteome analysis and its property was finally confirmed by using a fed-batch fermentation and molasses simulation liquid. In addition, to redesign the high yield succinic acid producing strain, genetic modification has been carried out with carbon source diversification strategy. Finally, high yield and high productive complete homo succinic acid producing M. succiniciproducens in sucrose and glycerol medium as dual carbon sources has been constructed for the first time. Analyzing its proteome and considering the identified sucrose utilization system, it can be understood how the sucrose and glycerol can be used simultaneously by overcoming the catabolite repression mechanism.
본 연구에서는 단백체 분석 기법과 탄소원 다양화 전략을 이용하여, 순수 숙신산을 효과적으로 생산할 수 있는 맨하이미아 균주를 제작하였다. 여러 조건에서 비교 단백체 분석에 의한 세포 내 대사상태를 확인하였고, 그 결과 숙신산 생산의 증대를 위한 다양한 전략을 마련하였다. 특히, 생산성과 수율 측면에서 어떠한 방법으로 세포 대사를 디자인 할 것인가에 대한 명확한 방향제시를 통해 숙신산 생산 증대에 핵심적인 단서를 제공하였다. 이러한 결과는 피루브산의 생산을 최소화 시키면서 효과적??경제적으로 숙신산을 생산할 수 있는 방법인 수크로스를 활용한 전략으로 이어졌다. 하지만, 수크로스를 이용한 발효에서 예상과는 다르게 글루코스를 활용하였을 때에 비해 피루브산이 줄어들지 않는 것을 확인하였고, 이에 수크로스 대사 효소의 동정을 통한 수크로스 대사 최적화를 도모하였다. 수크로스 대사관련 효소의 동정 결과에 기반하여 숙신산 생산성을 최대화 할 수 있는 균주를 제작하였고, 이들을 적응진화 방법을 통해 숙신산 생산성을 최대화하면서 다양한 탄소원을 동시에 활용할 수 있는 균주제작에 성공하였다. 이들의 세포내 대사특성은 단백체 분석을 통해 또한 분석되었고, 이로서 탄소원 활용 및 세포성장을 증대시킬 수 있는 전략을 마련하였다. 또한, 수크로스 대사효소군의 동정결과를 바탕으로 고효율 순수 숙신산 생산균주를 설계하였고, 이들이 수크로스와 글리세롤을 동시에 활용할 수 있는 능력을 보임을 발견하였다. 더불어 단백체 분석을 통해 이들의 특성이 이화산물 저해 기작의 극복을 통해 이루어졌음을 발견하였고 결국 이러한 전략이 전반적인 환원 화학물질의 바이오 기반 생산에 유용할 수 있음을 최초로 제시함으로서, 최종적으로는 맨하이미아 균의 대사공학적 개량에 의해 고효율 고생산성 고농도의 순수 숙신산 생산을 세계최초로 이루었다.
