L-Arabinose is the second most abundant sugar in the xylose mother liquor. L-Arabinose is converted to L-ribulose using L-arabinose isomerase. L-Ribulose is utilized as starting material for synthesizing L-ribose, a promising L-rare sugar to produce antiviral and anticancer L-nucleosides. As L-nucleoside analogues have less toxicity, greater metabolic stability due to their own stereochemistry and similar or even greater antiviral activity than their D-counterparts, L-ribose gets more importance. In this study, we constructed genetically modified Candida tropicalis to convert L-arabinose into L-ribulose and L-ribose from glucose/L-arabinose mixture.
For the uptake of L-arabinose as substrates, we tested two heterologous transporters GAL2 from Saccharomyces cerevisiae and STP2 from Arabidopsis thaliana. Endogenous xylose reductase harboring C. tropicalis L10 strain was transformed to constitutively translate codon-optimized GAL2 and STP2. The resulting strains, L10 CoGAL2 and L10 CoSTP2, were grown in fermentation medium containing L-arabinose. L10 CoSTP2 showed the highest L-arabitol production (40 g/L) from 50 g/L L-arabinose whereas L10 and L10 CoGAL2 produced 18 g/L L-arabinose during culture. The codon-optimized STP2 was rationale choice for efficient L-arabinose uptake in C. tropicalis.
We constitutively expressed catalytically efficient L-arabinose isomerase from Bacillus licheniformis in C. tropicalis and an increased conversion yield achieved with STP2. Additionally, with the help of STP2, various L-arabinose isomerases originated from Lactobacillus species were tested to increase conversion yield. As a result, L-arabinose isomerase from L. sakei 23K exhibited the highest conversion yield (30%, w/w).
Finally, L-ribose isomerase gene from Acinetobacter sp. strain DL-28 was optimized for construction of L-ribose-producing C. tropicalis strain. The resulting strains, K1 CoSTP2 23K AraA CoRI, produced 5 g/L of L-ribose and 3 g/L of L-ribulose from 30 g/L of L-arabinose. This constructed strain can be used for L-ribose production by fermentation with mixed sugars. Moreover, two stage culture was applied for consumption of residual sugars.
아라비노스는 자일로스 모액에서 두번째로 많은 단당류이다. 아라비노스는 아라비노스 이성질화효소에 의하여 엘-리불로오스로 전환된다. 엘-리불로오스는 항암제나 항바이러스제인 엘-핵산유도체의 생산에 이용되는 유용한 희소당 중의 하나인 엘-리보스 합성의 출발 물질로 이용된다. 엘-핵산유도체는 디-핵산유도체에 비하여 낮은 독성과 광학적 특성에 의한 높은 대사 안정성, 그리고 비슷하거나 높은 항바이러스 활성을 가지고 있기 때문에, 엘-리보스의 중요성은 점차 커지고 있다. 본 연구에서는, 글루코스/아라비노스 혼합물로부터 아라비노스를 엘-리불로오스와 엘-리보스로 전환하는 유전자 재조합 캔디다 트로피칼리스를 구축하고자 한다.
기질인 아라비노스의 흡수를 위하여, 이종의 수송단백질인 사카로마이세스 세레비지에 효모와 애기장대에서 유래된 수송단백질을 실험하였다. 캔디다 트로피칼리스 고유의 자일로스 환원효소가 발현되는 균주에 항구적으로 이종의 수송단백질이 항구적으로 발현되도록 형질 전환하였다. 구축된 균주는 아라비노스가 포함된 배양액을 이용하여 발효하였다. 50 g/L의 아라비노스에서 대조군은 18 g/L의 아라비톨이 생성된 반면, 애기장대 유래 수송단백질이 발현된 균주의 경우 40 g/L의 아라비톨이 생성되었다. 따라서, 애기장대 유래 수송단백질 발현을 통하여 혼합물에서의 아라비노스 이용이 증가됨을 확인하였다.
활성이 뛰어나다고 알려진 바실러스 리체니포미스의 아라비노스 이성질화효소를 항구적으로 발현시켰고, 애기장대 유래 수송단백질과 함께 발현될 경우 전환 수율이 증가됨을 확인하였다. 추가적으로 애기장대 유래 수송단백질과 함께, 락토바실러스 유래 아라비노스 이성질화효소를 발현하여 전환 수율을 높이고자 하였다. 락토바실러스 사케이 23K 유래 아라비노스 이성질화효소가 발현된 균주에서 가장 높은 수율 (30%, w/w)을 얻을 수 있었다.
최종적으로, 아시네토박터 유래 엘-리보스 이성질화효소를 항구적으로 발현하는 엘-리보스 생산 균주를 구축하였다. 구축된 균주는 30 g/L 아라비노스가 포함된 글루코스/아라비노스 혼합물로부터, 5 g/L 엘-리보스와 3 g/L 엘-리불로오스를 생산하였다. 이번 연구를 통하여 구축된 균주는 바이오매스 반섬유소 산가수분해물과 같은 혼합물을 배양액으로 사용하여 엘-리불로오스와 엘-리보스 같은 희소당 생산에 이용될 수 있다. 더욱이, 2단계 발효를 통하여 잔여 단당류의 소모도 확인할 수 있었다.
