Most of the biopharmaceuticals are glycoproteins. The glycosylation of recombinant therapeutic proteins is one of the most important factors that determines various pharmacological properties. Especially, sialylation regulates the in vivo half-life of recombinant therapeutic glycoproteins, affecting their therapeutic efficacy. Here, we show that the sialylation level of recombinant human erythropoietin (rhEPO) was increased by enhancing N-glycan antenna branching and sialylation pathway. Initially, we introduced heterogenous Nacetylglucosaminyltransferases (GNT) to maximize the N-glycan branching up to hexa-antennary, the theoretical
maximum level. We were able to obtain rhEPO with penta-antenna N-glycan structure only in GNTVI from Hen oviduct introduced CHO cells. However, determining whether a glycan composition is penta-antennary or polyLacNAc was challenging especially in highly branched N-glycans. Hence, we tried to eliminate polyLacNAc portion on rhEPO by inhibiting expression of β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2 (β3gnt2) to reduce complexity of N-glycan with high level of branch. Although we successfully reduced polyLacNAc on rhEPO, ratio of the penta-antenna structure was only found up to 4% of total N-glycan which is not significant level. Fortunately, however, we found that repression of the key polyLacNAc biosynthesis enzyme β3gnt2 increases the
multi antennary (tri-, tetra-) N-linked glycan structures which have enlarged capacity for sialic acid. We noticed that inhibition of polyLacNAc biosynthesis by depletion of β3gnt2 induced N-glycan branching, however, sialylation of rhEPO was not significantly increased because of negative feedback by intracellular cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid (CMP-Neu5Ac). Because CMP-Neu5Ac is a limiting factor for sialylation, we observed a significant increase in the sialylation of rhEPO produced in metabolically engineered CHO cells when we combined the inhibition of polyLacNAc biosynthesis with a release of CMP-Neu5Ac feedback inhibition. Upon further analysis of the resulting N-glycosylation pattern, we discovered that the enhanced rhEPO sialylation could be attributed to a decrease in di-sialylated N-glycans and an increase in tri- and tetra sialylated N-glycans. Our results suggest the novel way of improving glycoprotein sialylation by shunting GlcNAc and Gal away from polyLacNAc biosynthesis but toward N-glycan branch formation.
치료용 단백질의 대부분은 당쇄에 의해 수식된 당단백질이다. 이러한 당단백질의 당쇄화는 다양한 약리학적 특성을 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나이다. 특히, 당쇄 말단의 시알릴화는 치료용 재조합 단백질의 생체 내 반감기를 조절하여 치료효능에 큰 영향을 미친다. 본 연구에서는 N-결합 당쇄의 분지화와 시알산 대사회로를 동시에 강화함으로써 재조합 인간 에리스로포이에틴의 시알릴화를 더욱 강화하고자 하였다. 이를 위하여 외래의 N-아세틸글루코사민 전이효소를 도입을 통하여 N-결합 당쇄의 분지가 다섯개 이상을 갖도록 유도하여 시알산의 함량을 증가시키고자 하였으나, N-결합 당쇄의 분지화 정도가 높아지면서 전하량 대비 질량의 값이 동일한 구조적 이성질체의 경우의 수가 많아짐에 따라 정량적인 분석의 어려움이 있었다. 이를 극복하기 위해서 폴리락토사민 합성의 핵심 유전자인 베타1,3-N-아세틸글루코사민 전이효소 2 (β3gnt2) 의 발현을 저해하여 이성질체의 경우의 수를 낮추는 시도를 하였다. 이를 통해 폴리락토사민 구조의 비율을 크게 감소시켰으나, 다섯 개 이상의 N-결합 당쇄 분지는 전체의 4% 수준까지만 확인되었다. 하지만 폴리락토사민 구조가 감소하면서 부가적으로 세 개 및 네 개의 분지를 갖는 N-결합 당쇄 구조비율이 현저히 증가됨을 확인하였고, 이를 적용하여 시알산 함량을 증가시키기고자 하였다. 하지만 N-결합 당쇄의 분지화가 증가하여도 시알산 합성전구체인 시티딘 이인산염 N-아세틸뉴라민산(CMP-Neu5Ac) 의 세포내 함량이 음성 피드백에 의해 유지되기 때문에 시알산의 함량이 유의미하게 증가되지 않았다. 이를 극복하기 위해 본 연구팀의 선행연구결과에서 구축된 CMP-Neu5Ac 음성피드백이 제거된 세포주에서 폴리락토사민의 합성을 저해한 결과, 확장된 N-결합 당쇄 분지와 더불어 세포내 시알산 함량도 함께 증가하는 것을 확인하였다. 특히 질량분석을 통하여 시알산 함량의 증가가 시알산이 두 개 붙어 있는 N-결합 당쇄의 비율이 감소함과 동시에 세 개 및 네 개의 시알산이 붙어 있는 N-결합당쇄의 비율이 증가함 때문임을 확인하였다.
