Over the past few decades, tissue engineering and regenerative medicine (TERM) technologies have experienced vast expansion, allowing for the creation of proper structural and biochemical environment for cells that closely mimics those found in living organisms. Conventional two-dimensional (2D) surfaces, such as micro-well plates, flasks, and plastic substrates, have limitations in providing microenvironments that are compatible with in vivo conditions due to their inherent differences in properties. As a result, the concept of three-dimensional (3D) cell culture has gained popularity as it allows for the creation of an in vivo-like environment in vitro. This is particularly relevant for studies involving in vitro construction of environment that emulate native tissues for neural cells, as more proximate resemblance to the intricacies of native central nervous system (CNS) can lead to a more accessible understanding of neural cell behaviors at the cellular and molecular levels.
As one of the biggest targets of the TERM technologies is to repair the nerve system, thereby researchers were strived to find an ultimate key to cure neurological disorders, such as stroke, traumatic brain injury, Alzheimer’s disease, and Parkinson’s disease. However, due to the extra-sensitive response to the environment and poor regenerative ability of neural cells, limited access to in vivo brain tissue, and a lack of simulation systems that can be replicated for in vitro studies, progress in understanding the central nervous system (CNS) and illuminating mechanisms of these neurological disorders has been impeded. In this aspect, we designed strategies for the construction of novel 3D cell culture system based on brain-derived, decellularized extracellular matrices.
To provide a more accurate imitation of tissue-specific environment to cells, using ECMs of CNS tissue itself has recently emerged as a reliable candidate as a plausible alternative. This method involves decellularization of cells from desired tissue, and using the remnants for the provision of a tissue-like environment, called decellularized ECMs (dECMs). The dECM can not only be utilized as a scaffold for implantation but also as an injectable, in situ self-assembling hydrogel for regenerative medicine. In this thesis, we utilized brain-derived dECMs (bdECMs) as a form of hydrogels to take advances of biologically relevant properties, such as tissue-like stiffness, tunable viscoelasticity, and ease of diffusion of oxygen, nutrients, and waste products.
First, we proposed the decellularization of brain tissue derived from Sus scrofa domesticus as model bdECM for further construction of a 3D neural cell culture system. The bdECMs were decellularized and characterized by various methods, including proteomic analysis. Decellularization processes that were adapted to form bdECMs enabled the retention of the unique chemical compositions of the original tissue while minimizing cytotoxicity.
Next, we induced 3D bdECM hydrogel scaffolds as astrocyte culture platform. Astrocytes, cultured in 3D bdECM scaffolds, exhibited in-vivo-like characteristics, such as stellate morphology, profoundly distinct from the flat, polygonal structures of astrocytes on the 2D culture platform. The transcriptomic analysis confirmatively showed significant differences in gene expression of astrocytes between 3D bdECM and 2D cultures.
Lastly, we incorporated 3D bdECM hydrogel scaffolds neuronal and neuron-astrocyte co-culture platform. Microfluidic device was induced for the fabrication of bdECM hydrogel in micro-scale, results to the neuron-seeded microstructure that can aggregate and form macrostructure. Furthermore, neurons cultured on astrocyte-encapsulated bdECM hydrogels presented advanced neuronal development and neural circuit formation, implying the neurosupportive properties of astrocytes in bdECMs.
Together, we developed bdECM-based 3D neural cell culture platforms that can be incorporated with both neurons and astrocytes in various dimension and formation. Although the methods were only suggesting the possibilities of the system as a model, we expect that these strategies can well-suited throughout neural tissue engineering fields, from biomaterial-based 3D neural cell culture platform to actual therapeutics.
지난 수십 년 동안 조직 공학 및 재생 의학 기술이 크게 확장됨으로 인하여 세포 배양에 알맞는 생체 내와 유사한 구조적 및 생화학적 환경을 조성할 수 있게 되었다. 기존의 이차원 표면은 고유한 특성 차이로 인해 생체 내 조건과 호환되는 미세 환경을 제공하는 데 한계가 있었기 때문에, 그 결과 체외에서도 생체 내와 유사한 환경을 조성할 수 있는 삼차원 세포 배양이라는 개념이 최근 인기를 얻고 있다. 특히 이는 신경세포 배양 연구에서 실제 조직을 모방한 환경을 생체 외에서 구축하는 것과 관련이 깊은데, 실제 중추신경계의 복잡성에 가까워질수록 생체 외 연구에서도 세포 및 분자 수준에서의 신경세포의 생체 내 행동의 더 쉬운 이해가 가능해지기 때문이다.
조직 공학 기술의 가장 큰 목표 중 하나는 신경계에서 흔히 발생하는 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 신경 장애를 치료할 수 있는 궁극적인 해결 방안의 발견이다. 그러나 이러한 해결에 필수적으로 여겨지는 중추신경계 및 신경계 질환의 메커니즘에 대한 이해는 환경에 매우 민감하게 반응하고 재생 능력이 떨어지는 신경세포의 특성, 활동 상태의 뇌 조직에 대한 접근의 어려움, 생체 외 연구를 위한 모의 시스템의 부재 등으로 인해 그 진전이 저해되고 있다. 이러한 측면에서, 우리는 탈세포화 세포외기질(dECM)을 기반으로 새로운 삼차원 세포 배양 시스템을 구축하기 위한 전략을 설계하였다.
신경세포가 본래 존재하는 조직 고유의 환경을 보다 정확하게 모사하기 위하여, 중추신경계 조직 자체의 세포외기질을 사용하는 것이 최근 유력한 대안 가운데 하나로 떠오르고 있다. dECM을 활용한 조직 공학 연구는 연구자가 원하는 조직에서 세포를 탈세포화한 후 추출된 세포외기질을 이용, 조직과 유사한 환경을 제공하는 것으로, dECM은 이식을 위한 비계로 활용될 수 있을 뿐만 아니라 재생 의학을 위한 주사 가능한 현장 자기조립형 하이드로겔로도 활용 가능하다는 장점이 있다. 본 연구에서는 뇌 조직 유래 dECM (bdECM)을 하이드로겔로 활용함으로써 조직과 유사한 강성, 조절 가능한 점탄성, 산소, 영양분, 노폐물의 확산 용이성 등의 장점을 취하고자 하였다.
먼저, 삼차원 신경세포 배양 시스템을 구축하기 위해 뇌 조직을 탈세포화한 후 이를 bdECM 모델로 활용코자 하였다. bdECM은 단백질체 분석을 포함한 다양한 방법을 통해 특성을 분석하였다. 탈세포화 과정을 통하여 차후 배양될 세포의 면역반응을 최소화하면서 원래 조직의 고유한 화학적 구성을 유지할 수 있는 bdECM을 추출하였다.
다음으로, 삼차원 bdECM 하이드로겔을 이용한 별아교세포 배양 플랫폼을 구축하였다. 3차원 bdECM 비계에서 배양된 별아교세포는 이차원 배양의 평면 다각형 형태와는 확연히 구별되는 별 형태를 띄며, 전사체 분석과 같은 생화학적 분석을 통해 삼차원 bdECM 하이드로겔이 별아교세포의 생체 내 유사 특성을 나타내는 것에 일조하였음을 확인하였다.
마지막으로, 삼차원 bdECM 하이드로겔을 이용한 신경세포 및 신경세포-별아교세포 공동 배양 플랫폼을 구축하였다. 미세유체소자기술을 활용, 마이크로 크기의 bdECM 하이드로겔 마이크로구조체를 제작하고, 이후 결합을 통한 거시구조를 형성할 수 있는 신경세포 배양 미세구조를 얻을 수 있었다. 또한 별아교세포 피포화된 bdECM 하이드로겔 상에서 배양된 신경세포의 수상돌기 발달과 신경 회로 형성에의 진전을 확인함으로써 bdECM 상에서의 공동 배양 시 별아교세포의 신경 지원 특성이 발현됨을 시사하였다.
요컨대, 우리는 신경세포와 별아교세포를 다양한 크기와 형태의 bdECM 기반 삼차원 신경세포 배양 플랫폼 상에서 배양할 수 있는 방법론을 개발했다. 모델 시스템으로서 그 가능성을 제시하였으며, 본 방법론은 생체재료 기반 삼차원 신경세포 배양 플랫폼부터 실제 치료에 이르기까지 신경조직공학 분야 전반에 걸쳐 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
