The gene CLCN4, which is highly expressed in the brain, exhibits variants that have been linked to neurodevelopmental disorders, such as intellectual disabilities, epileptic seizures, and autistic features. The expression patterns of CLCN4 and the observed phenotypes resulting from CLCN4 variants strongly suggest a significant role of CLCN4 in brain development. However, there is limited knowledge regarding the biological roles for CLCN4 in neurodevelopment and the specific effects of CLCN4 variants on neurodevelopmental processes. To address this issues, genome editing technique was applied to generate the human embryonic stem cells (hESCs) harboring CLCN4 variant, which were subsequently differentiated into brain organoids and neurons. The brain organoids derived from hESCs carrying CLCN4 variants exhibited a decreased population of excitatory neurons. Notably, when neural progenitor cells (NPCs) were differentiated into excitatory neurons, the experienced early-stage neuronal cell death and abnormal neurite development were observed in CLCN4-variant neurons. Also, it was verified that an accumulation of vesicles in the endo-lysosomal pathway and a decrease in autophagy within CLCN4-variant neurons. RNA sequencing analysis of CLCN4-variant neurons revealed altered expression of genes involved in neurodevelopmental processes. Through the gene expression profile analysis, MEG3, was found to be the most significantly changed. Manipulation of MEG3 expression could rescue phenotypes observed in CLCN4-variant neurons, including cell death. This study highlights the impact of CLCN4 variants on neuro-developmental phenotypes, particularly cell death, and emphasizes the potential of MEG3 activation in restoring these phenotypes. The findings not only underscore the pivotal role of CLCN4 in brain development but also offer potential therapeutic implications for the treatment of CLCN4-related neurodevelopmental disorders.
CLCN4는 염소 이온 채널인 CLC-4를 암호화하는 유전자로, CLCN4의 발현은 뇌에서 가장 높으며, CLCN4 변이를 가지는 환자는 지적 장애, 발작, 자폐적 특징과 같은 신경 발달 장애를 동반한다고 알려져 있다. 이와 같은 CLCN4의 발현 양상 및 CLCN4 변이로 인한 표현형은 해당 유전자가 뇌 발달 과정에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 하지만 현재까지 뇌에서 CLCN4의 기능 및 CLCN4 변이가 신경 발달 과정에 어떻게 기여하는 지에 관해서는 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 유전자 편집 기술을 통해 CLCN4 변이를 가지는 인간 배아줄기세포를 생성한 후 뇌 오가노이드(brain organoid) 및 신경세포를 형성한 결과, 흥미롭게도 신경세포 수의 감소 및 초기 신경 분화 단계에서 신경세포의 사멸을 관찰하였다. 또한, 세포 사멸 이전의 CLCN4 변이 신경세포에서 신경 돌기의 변화와 엔도좀 및 리소좀의 축적된 양상 및 자가포식(autophagy)의 감소를 규명하였다. 뿐만 아니라, CLCN4 변이 신경세포의 전사체를 분석한 결과, 신경 발달 관련 유전자들의 발현이 변화함을 확인하였다. 마지막으로, CLCN4 변이 신경세포 전사체 중 가장 유의미하게 변화한 MEG3의 발현 조절을 통해 세포 사멸을 비롯한 CLCN4 변이 신경세포의 표현형이 회복됨을 확인하였다. 본 연구 결과를 통해, CLCN4 유전자가 뇌 발달 과정에 중요한 역할을 수행함을 확인하고 인간 신경 발달 과정에서 CLCN4 변이에 의한 영향을 규명하였다. 더 나아가 본 연구는 CLCN4 관련 신경 발달 장애의 치료 타겟으로 MEG3의 가능성을 제시하는 바이며, 이를 통해 본 연구 결과가 CLCN4 연관 신경 발달 장애 환자 치료에 도움이 될 것으로 예상된다.
