Beyond the canonical role of RNA in conveying sequence-embeded genetic information, recent studies have shown that RNA also transmit a biological signal through its structure. Double-stranded RNA (dsRNA) is an important pathogen-associated molecule pattern (PAMP) as viruses produce long dsRNA molecules as a byproduct during viral replication. In vertebrates, the innate immune system recognizes the dsRNA structure rather than a specific nucleotide sequence and induces an antiviral state to defend against viral infection. This structure-mediated recognition allows innate immune proteins to bind endogenous dsRNAs as well and induce subsequent signaling transductions. In this thesis, I will discuss the capturing method of dsRNA using their structural characteristic as well as its application to the detection of viral dsRNA and studying the biological role of endogenous dsRNA structure. In Chapter 1, reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) (PPFPA)-grafted surfaces were used to immobilize dsRNA recognizing J2 antibody to construct a universal virus detection platform with enhanced sensitivity. The PPFPA-grafted silicon substrate was optimized for biomolecule immobilization by modulating surface hydrophilicity. To increase the long dsRNA detection sensitivity, a two-step method is devised where the captured dsRNAs are visualized with multiple fluorophore-tagged J2 antibodies. This universal virus detection platform successfully detected the dsRNAs from the lysate of hepatitis A or C virus-infected cells. Chapter 2 will discuss the biological role of inverted repeats of Alu (IRAlus) elements, which form dsRNA structure that can lead to nuclear sequestration and subsequent translational suppression of the host mRNA. Genes that contain functional IRAlus elements were initially identified, and by utilizing J2 formaldehyde-mediated cross-linking immunoprecipitation and sequencing (fCLIP-seq), I greatly expanded the number of genes that contain IRAlus elements that can induce gene silencing effects. With this method, I found a new mechanism for the crosstalk between alternative polyadenylation and endogenous dsRNAs in the post-transcriptional regulation of numerous biological processes including MDM2-p53 associated tumorigenesis and neurodegenerative diseases. Collectively, this thesis will extend our knowledge of the structural characteristics and biological role of the viral dsRNA as well as the endogenous dsRNAs.
RNA는 DNA에 저장된 유전정보를 단백질로 번역하는 데에 서열 정보를 전달하는 역할 외에도 RNA 자체의 구조적 특징을 통해 다양한 생물학적 역할을 수행한다. RNA가 이루는 구조 중 단일 가닥 RNA 두 개가 상보적으로 결합한 이중나선 RNA는 바이러스 감염의 표지자로, 선천성 면역체계는 이러한 이중나선 RNA 구조를 인식하여 세포를 항바이러스 상태로 전환시켜 바이러스 감염에 대응하는 것으로 잘 알려져 있다. 본 학위논문에서는 이중나선 RNA를 포집할 수 있는 기술을 활용하여 바이러스성 이중나선 RNA를 검출법, 그리고 세포에 자연적으로 존재하는 이중나선 RNA들의 생물학적 기능에 대해 연구하였다. 제 1장에서는 poly(pentafluorophenyl acrylate) (PPFPA) 고분자 표면에 이중나선 RNA 항체인 J2 항체를 고정한 뒤, 이를 활용한 만능 바이러스 검출 플랫폼을 개발하였다. 해당 플랫폼은 표면친수성을 개선하여 생체분자 고정력을 높였다. 또한, 바이러스 이중나선 RNA와 같은 길이가 긴 이중나선 RNA를 검출하기 위하여, 다수의 형광표지된 J2 항체를 사용하여 포집된 이중나선 RNA를 검출하는 신호 증폭 단계를 추가하였다. 해당 플랫폼은 A형 또는 C형 간염 바이러스에 감염된 세포의 용해액에서 RNA 추출과정 없이 바이러스 감염 여부를 확인하는 데에 성공하였다. 제 2장에서는 인체에서 바이러스 감염 없이도 이중나선 RNA 구조를 이룰 수 있는 Alu 반복요소의 생물학적 기능에 대해 연구하였다. Alu 반복요소는 mRNA를 핵 안에 갇히게 하여 단백질 번역능을 감소시키는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 해당 연구에서는 J2 항체를 활용한 포름알데히드 가교면역침강 방법을 사용하여 이중나선 RNA 구조를 가지는 Alu 반복요소를 다수 동정하였다. 이를 바탕으로, 세포 내에 자연적으로 존재하는 이중나선 RNA는 대체폴리아데닐화를 통해 암 형성 및 진행에 관련이 있는 MDM2-p53 경로나, 다양한 퇴행성뇌질환에서 중요한 역할을 수행하고 있음을 확인하였다. 이를 통하여 해당 학위논문에서는 바이러스성 또는 세포 내재 이중나선 RNA의 구조적인 특징과 이들의 생물학적 기능을 이해하는 데에 큰 기여를 하였다.
