Pancreatic endocrine cells (EC) are responsible for glucose homeostasis through the coordination of glucagon and insulin from alpha and beta cells, respectively. For the treatment of diabetes, in vitro differentiation of pancreatic ECs from human pluripotent stem cells is massively studied. During the pancreatic EC development, endocrine progenitor cells (EP) transiently express NEUROGENIN 3 (NGN3). NGN3 is a basic helix-loop-helix transcription factor that is activating EC-associated genes such as NEUROD1, PAX6, PAX4, and NKX2.2. It lasts only a few hours in individual EPs, however, its deficiency leads to pancreatic EC agenesis. Therefore, understanding the NGN3 regulation mechanism in EPs is critical for EC differentiation. It is known that multi-phosphorylation of NGN3 by CDKs is important for its transcriptional activity and ubiquitin-mediated degradation, but other modifications are not elucidated yet. Arginine methylation of non-histone proteins regulates protein functionality and stability. PRMT1 is a predominant type I arginine methyl-transferase in mammalian cells. In this study, a PRMT1-inducible knockout (KO, P-iKO) hESC line was generated to discover the role of PRMT1 during pancreatic EC differentiation in vitro. PRMT1 depletion in EPs leads to accumulation of NGN3 and impaired EC development. Using the NGN3-T2A-eGFP hESC line, it was confirmed that PRMT1-KO does not alter NGN3 transcripts itself. Based on these results, Arginine 65 methylation of NGN3 by PRMT1 is essential for proper EC development from hESCs. Also, this modification was critical for transcriptional activity and rapid ubiquitin-mediated degradation of NGN3.
혈당의 항상성은 췌장 내분비세포에서 분비되는 글루카곤과 인슐린의 조화로부터 유지된다. 인슐린의 분비나 작용에 문제가 생기면 당뇨병이 유발되며, 치료의 일환으로써 인간 만능 줄기세포로부터 췌장 내분비세포로의 분화법이 전 세계적으로 연구되고 있다. 내분비세포는 NEUROGENIN 3 (NGN3)를 일시적으로 발현하는 전구체세포로부터 분화한다. NGN3는 내분비세포 관련 유전자들을 전사시켜 분화를 유도하며, 다중 인산화로 인해 활성과 안정성이 조절된다. 하지만 NGN3의 조절에 메틸화가 관여하는지는 밝혀지지 않았다. 세포 내 아르기닌의 메틸화는 단백질의 기능과 안정성에 영향을 주며, 주요 효소는 단백질 아르기닌 메틸화효소-1 (PRMT1)로 알려져 있다. 본 연구에서는 유전자 편집을 통하여 분화 중 PRMT1을 낙아웃 시킬 수 있는 인간 배아줄기세포주를 제작, 췌장 내분비세포로의 분화에서 PRMT1의 역할을 규명하였다. 내분비전구체세포에서 PRMT1의 결핍은 NGN3 단백질의 축적을 유발하고 내분비세포로의 분화를 저해하였다. 또한 NGN3-T2A-eGFP 세포주를 제작, PRMT1의 결핍이 NGN3 전사체의 양 자체에는 영향이 없음을 확인하였다. NGN3 과발현 세포를 제작, 세포 내 PRMT1과의 상호작용을 확인하였고, NGN3의 65번 아르기닌에 메틸화가 일어남을 보았다. 이를 바탕으로 췌장 내분비전구체세포에서 PRMT1에 의한 NGN3의 65번 아르기닌 메틸화가 내분비세포의 정상적인 발달에 관여함을 밝혔다. 또한 이 메틸화는 NGN3의 전사기능 활성과 세포 내 유비퀴틴에 의한 빠른 분해에 필수적이었으며, NGN3의 인산화에도 영향이 있음을 확인하였다.
