Since ancient times, humanity has acknowledged the existence of cancer and has made efforts to develop various therapeutic agents to overcome it. After the 1900s, radiation therapy, chemotherapy, and targeted therapy were developed; however, they were found to have serious side effects and limitations due to high treatment resistance. Since the 2000s, immunotherapy using the immune system for anticancer treatment has been actively researched. In particular, since 2010, therapy using chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells, which express chimeric antigen receptors through genetic engineering to recognize cancer cells, has been developed, showing high treatment efficacy of over 80% in patients with acute lymphoblastic leukemia. However, CAR-T cells, which demonstrated high anticancer efficacy, also have many limitations. For example, there is antigen-negative relapse, which is found in over 20% of treatment-failed patients. Moreover, CAR-T cells targeting solid tumors, unlike hematologic cancers, show low treatment efficacy and high relapse rates. Many researchers believe that the absence of antigens targeted by CAR-T cells is a common cause of these two limitations. To overcome these limitations, I developed multi-antigen-specific CAR-T cells that target multiple antigens simultaneously. However, in patients receiving treatment with multi-antigen-specific CAR-T cells, cancer relapse without expressing all the targeted antigens was observed, indicating that the limitations caused by antigen-negative relapse have not yet been overcome. To overcome these limitations of targeted immunotherapy, I aimed to develop a method of delivering specific antigens to cancer cells and design a treatment method using single-antigen-specific CAR-T cells to target the labeled antigens.
In this study, I aimed to deliver antigens to the surface of cancer cells through genetic and chemical methodovvcd19s. To achieve genetic antigen delivery, I used oncolytic viruses to deliver the CD19 antigen. Experimental results confirmed the expression of the CD19 antigen in breast cancer-derived cell lines with high antigen heterogeneity, and the effective cytotoxicity of anti-CD19 CAR-T cells against CD19-expressing cancer cells was observed. Furthermore, in a breast cancer xenograft mouse model, CD19 expression was confirmed following the administration of oncolytic viruses. Additionally, to achieve cancer cell-specific CD19 antigen expression, I exchanged the promoter regulating CD19 antigen expression and confirmed cancer cell-specific antigen expression. Subsequently, in vivo experiments, the efficacy of anticancer treatment was observed in mice with oVVCD19 administration, regardless of the administration of anti-CD19 CAR-T cells, and mouse deaths due to virus toxicity were confirmed.
Next, to label antigens on the surface of cancer cells chemically, I aimed to use metabolic glycan labeling with unnatural monosaccharides. The azido-conjugated mannosamine and BCN-FITC successfully labeled FITC on the surface of cancer cells, and the efficient cytotoxicity and cellular activity of anti-FITC CAR-T cells were observed. Moreover, in a xenograft mouse model injected with FITC-labeled cancer cells, the successful inhibition of cancer cell growth by anti-FITC CAR-T cells was confirmed. Furthermore, to confirm whether unnatural sugars can directly induce the activity of CAR-T cells, I used hapten conjugated unnatural sugar. The labeling of DNP antigens on the surface of cancer cells by Sia-DNP, a DNP conjugated sialic acid, was confirmed, and the cytotoxicity and activation of anti-DNP CAR-T cells were verified. Furthermore, successful DNP surface labeling with Sia-DNP and high anticancer efficacy by anti-DNP CAR-T cells were confirmed in animal experiments. Furthermore, I confirmed the applicability of this approach to cancer cells derived from other tissues, not limited to breast cancer, using prostate cancer cell lines.
인류는 고대부터 암의 존재를 확인하고, 암을 극복하기 위해 현재까지 다양한 치료제를 개발하기 위해 힘써왔다. 1900년대 이후, 방사선 치료요법, 항암화학요법, 그리고 표적 항암 치료요법이 개발되었으나, 심각한 부작용과 높은 치료 내성의 한계점이 확인되었다. 2000년대 이후 면역 체계를 이용한 항암 면역 치료제가 활발히 연구되었다. 특히 2010년 이후, T 세포에 유전자 변형을 통해 암세포를 인식하는 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 키메릭 항원 수용체 T 세포를 이용한 치료 요법이 개발되었으며 이는 급성 림프구성 백혈병 환자를 대상으로 80%가 넘는 높은 치료 효과를 보였다. 그러나 높은 항암 효능을 보인 키메릭 항원 수용체 T 세포 역시 많은 한계점을 가지고 있다. 대표적으로 치료 실패 환자의 20% 이상에서 발견되는 항원 음성 재발이 있다. 또한 혈액암과 달리 고형암을 대상으로 하는 키메릭 항원 수용체 T 세포는 낮은 치료 효과와 높은 재발율을 보이고 있다. 많은 연구자들은 위 두 가지 한계의 공통된 원인으로, 키메릭 항원 수용체 T 세포가 표적하는 항원의 부재가 중요 원인으로 예상된다. 이러한 한계를 극복하고자 다양한 항원을 한번에 표적하는 다중 항원 특이적 키메릭 항원 수용체 T 세포를 개발하였다. 하지만 다중 항원 특이적 키메릭 항원 수용체 T 세포 투여 환자에게서 여러 항원을 모두 발현하지 않는 암의 재발이 확인되어, 여전히 항원 음성 재발에 의한 한계를 극복하지 못했다. 이러한 표적 면역세포 치료의 한계를 극복하기 위해, 암세포에게 특정 항원을 전달하여 표지하는 방법을 개발하고 표지된 항원을 표적하는 단일 항원 특이적 키메릭 항원 수용체를 이용한 치료 방법을 고안하고자 하였다.
본 연구에서는 암세포 표면에 항원을 전달하기 위해 유전적 그리고 화학적 방법을 통해 항원을 전달하고자 하였다. 유전적 항원 전달을 하기 위해 암 융해 바이러스를 이용하여, CD19 항원을 전달하였다. 실험 결과 항원 이질성이 높은 유방암 유래 세포주에서 CD19 항원이 발현됨을 확인할 수 있었으며, CD19 항원 발현 암세포에 대한 anti-CD19 CAR-T 세포의 효과적인 세포 독성을 확인할 수 있었다. 나아가 유방암 이식 쥐 실험에서, 항암 융해 바이러스 투여에 따른 CD19 발현을 확인하였다. 또한 암세포 특이적 CD19 항원 발현을 위해, 항원 발현을 조절하는 프로모터를 교환하여 암세포 특이적 항원 발현을 확인하였다. 이후 동물실험에서, CD19 발현 항암 융해 바이러스 투여 쥐에서 anti-CD19 CAR-T 세포의 투여에 상관없이 항암 효능이 확인되었으며 바이러스 독성에 의한 쥐의 사망을 확인하였다.
다음으로, 암세포 표면에 화학적 항원 표지를 하기 위해 비자연적 당을 이용한 대사 글리칸 표지를 이용하고자 하였다. 아지도 그룹 결합 만노사민과 BCN-FITC는 성공적으로 암세포 표면에 FITC를 표지할 수 있었으며, anti-FITC CAR-T의 효율적인 세포독성 및 세포 활성을 확인할 수 있었다. 또한 FITC 표지된 암세포를 쥐에게 주입한 모델에서 anti-FITC CAR-T 세포가 성공적으로 암세포 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 비자연적 당이 직접 CAR-T 세포의 활성을 유도할 수 있는지 확인하기 위해 햅튼 결합 비자연적 당을 사용하였다. 그 결과 DNP 분자가 결합된 시알산에 의한 암세포 표면의 DNP 항원 표지를 확인하였으며, anti-DNP CAR-T 세포의 세포 독성 및 T 세포 활성을 확인했다. 또한 동물실험에서 Sia-DNP에 의한 성공적인 DNP 표면 표지와 anti-DNP CAR-T 세포에 의한 높은 항암 효능을 확인했다. Sia-DNP를 이용한 세포 표지 및 anti-DNP CAR-T 세포의 세포 독성은 다양한 유방암 세포주에서 작동하였으며, 동물실험에서도 대사 글리칸 표지를 이용한 암세포 표지가 항원 음성 세포를 표적할 수 있는 대안임을 확인하였다. 나아가 해당 방안이 유방암에 국한되지 않고 다른 조직 유래 암세포에 이용할 수 있음을 전립선암 세포주를 이용하여 확인하였다.
