The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, which is the causal agent of pine wilt disease, has become a serious threat to forest ecosystem. To control these disastrous pine wilt disease, chemical pesticides such as abamectin and emamectin benzoate had been introduced to be used as nematicides. However, there has been concern about these pesticides, which could pose side effects as they have lethal activities against a broad range of hosts. Efficient and environmentally beneficial alternatives to existing pesticides, which do not affect non-target organisms, are therefore urgently required. For this purpose, natural enemies would be an excellent source model for discovering novel agents. Esteya vermicola was reported as a first endoparasitic nematophagous fungus that attacks the pine wood nematode. Although the infection activities of E. vermicola had been verified as a biocontrol agent of pine wilt disease, how they attack pathogenic nematodes are still not fully understood. Therefore, it would be valuable to find out the biologically active agents from this natural systems followed by clarification of the underlying infection mechanism. In this study, I identified the potential virulences gene, EVERM_004614 involved in infection process through genome and transcriptome analysis of E. vermicola from nematode-fungi infection model. For functional analysis, knockout and overexpression strains of EVERM_004614 were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated homologous recombination. Comparative infection assay conducted with knockout and wildtype strains against B. xylophilus reavealed that EVERM_004614 plays a highly significant role in infection process. For purification and structural elucidation of compound biosynthesized from EVERM_004614, culture condition and extraction solvents were tested to obtain sufficient amount of target compounds. Furthermore, the retention time and absorption characteristic of four desired compounds were determined based on the comparative analysis of HPLC profile between wildtype and mutant strains. This work would pave a way to find environmentally beneficial alternatives, with unprecedented approaches which explore the nematicidal agent from the natural enemy of pine wood nematode.
소나무 재선충병의 직접적인 원인이 되는 소나무재선충은 산림생태계에 심각한 위협이 되고 있다. 이러한 재앙적인 소나무재선충병을 제어하기 위해 화학 살충제(아바멕틴, 에마멕틴벤조에이트 등)가 도입되어 살선충제로 사용되어왔다. 그러나 이러한 살충제는 광범위한 숙주에 대해 치명적인 활성을 나타내므로 부작용을 일으킬 수 있다는 우려가 있어왔다. 이에 비표적 유기체에 영향을 미치지 않으며, 기존 살충제 보다 효율적이고 환경적으로 유익한 대안이 시급히 요구되고 있다. 이를 위해 생물학적인 천적을 이용하는 것은 새로운 대안책을 마련하는데 있어 훌륭한 원천이 될 수 있다. 소나무재선충 천적 진균으로 알려진 Esteya vermicola는 소나무재선충을 공격하는 최초의 체내 기생 선충으로 보고되었다. 소나무재선충의 생물학적 방제제로서의 효능은 충분히 입증되었으나 아직까지 재선충을 제어하는 메커니즘에 대한 이해는 이루어지지 않았다. 자연계 유래 천적 미생물의 감염메커니즘을 이해하는 것은 살선충 활성이 높은 바이오소재를 찾는데 있어 중요하게 작용할 수 있다. 본 연구에서는 재선충-기생성 진균 감염 모델로부터 E. vermicola의 유전체 및 전사체 분석을 통해 감염 과정에 관여하는 잠재적 병원성 관련 유전자인 EVERM_004614를 발굴하였다. 기능적인 분석을 위해 Agrobacterim tumefaciens 매개 상동 재조합 방법으로 EVERM_004614 유전자의 녹아웃 및 과발현 균주를 구축하였다. 구축한 녹아웃 및 야생형 균주의 B. xylophilus에 대한 감염능 비교 분석을 통해 EVERM_004614가 감염 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 밝힐 수 있었다. 이어서 EVERM_004614로부터 만들어지는 살선충 활성 물질의 정제 및 구조 규명을 목적으로 테스트를 통해 살선충 바이오소재가 유도되는 배양 조건 및 추출조건을 결정하였다. 더 나아가 야생형균주와 돌연변이 균주 사이의 고성능 액체 크로마토그래피 프로파일의 비교 분석을 통해 4가지 후보 물질을 발굴하였으며, 해당 후보물질들의 머무름 시간 및 흡수 패턴을 규명하였다. 본 연구는 전례 없는 소나무 재선충의 천적 진균으로부터 살선충제를 발굴하는 방법으로 접근한 연구로 환경적으로 유익한 바이오소재를 찾는 길을 열어줄 것이다.
