Urea has been known to be inert. There are only a few reports on the potential biological effects of urea, including inhibition of the arginine transport in vascular endothelial cells and inhibition of glycolysis in pancreatic β-cells. In this study, I investigated whether high levels of extracellular urea influence macrophages and found that pathological concentrations of urea attenuated arginase-1 induction by IL-4 in murine macrophages in a dose-dependent manner at both transcriptional and translational levels, indicating that urea inhibits M2 polarization of macrophages. Other genes involved in M2 polarization of macrophages, such as Fizz1 and Ym1, were also significantly downregulated by urea. To examine the effect of urea on M2 macrophage polarization in vivo, IL-4/anti-IL-4 antibody complex was injected into control and urea-fed mice. Peritoneal macrophages from urea-fed mice showed lower arginase-1 expression than did macrophages from control mice. To elucidate the mechanism underlying the inhibitory effects of urea on macrophages, bulk RNA sequencing was performed using IL-4–treated bone marrow-derived macrophages (BMDMs) treated with different concentrations of urea. Gene set enrichment analysis (GSEA) of the RNA-seq data revealed that urea downregulated gene sets related to mTOR signaling, glycolysis, and oxidative phosphorylation. We confirmed that the phosphorylation of mTOR downstream molecules, such as S6 and AKT, was attenuated by urea. In addition, Seahorse real-time metabolic analysis revealed diminished extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) in urea-treated M2 BMDMs. Furthermore, LC-MS analysis of the intracellular metabolites associated with the urea cycle and the TCA cycle revealed that urea reduces the ratio of α-ketoglutarate/succinate which is known to be upregulated in M2 polarization. In line with these results, the urea did not further inhibit M2 polarization when M2 polarization of BMDMs were suppressed by treatment with pan-mTOR inhibitor. These results suggest that urea inhibits M2 polarization by attenuation of mTOR signaling in macrophages. Based on a previous report that urea induces carbamylation of mTOR molecules and impairs mTOR signaling in neurons, I tested whether mTOR was also carbamylated in urea-treated macrophages. However, urea did not enhance the carbamylation of mTOR molecules in M2 BMDMs. As observed in macrophages, phosphorylation of mTOR downstream molecules was also downregulated in CD8+ T cells. Urea also attenuated the activation and proliferation of CD8+ T cells in vitro and in vivo. Based on these results, I suggest that urea attenuates M2 macrophage polarization and effector differentiation of CD8+ T cells via inhibition of mTOR, and is no longer an inert molecule for macrophages and T cells.
요소는 오래 전부터 무독성 물질로 알려져 있고 요소의 잠재적 효과에 대한 보고는 아르기닌의 세포 내 수송 및 췌장 β 세포에서의 해당 과정을 저해한다는 것 외에는 거의 없다. 본 연구에서는 요소가 대식세포 기능에 영향을 미치는지 알아보았고, IL-4 자극에 의한 대식세포 M2 극화 시 유도되는 arginase-1의 전사 및 번역이 고농도 요소에 의해 감소되는 것을 확인하였다. Arginase-1 뿐만 아니라 Fizz1, Ym1 과 같은 M2 극화의 다른 대표적 표지자들 또한 요소에 의해 그 발현이 유의미하게 감소하는 것을 관찰하였다. 이러한 요소의 M2 극화 저해 효과는 요소가 포함된 물과 정상 물을 급여한 쥐들에게 각각 IL-4 복합체를 복강 내 주사하여 M2 극화를 유도하는 동물 실험에서도 검증할 수 있었다. 요소 물을 복용한 쥐들의 복강 내 대식세포에서 M2 대표 유전자들의 발현이 정상 물을 복용한 쥐들 보다 감소되어 있었다. 이는 요소의 M2 극화 저해 효과가 세포 수준뿐만 아니라 동물에서도 유의미한 현상임을 의미한다. 요소에 의한 M2 극화 저해의 기전을 확인하고자 IL-4가 처리된 골수유래대식세포의 전사체를 세포 군집 RNA 시퀀싱을 이용하여분석하였고, 요소가 처리된 M2 극화 대식세포에서 mTOR 신호전달 체계, 해당 과정, 세포 호흡 등과 관련된 유전자들의 발현이 감소되는 경향을 확인할 수 있었다. 또한, 대사체 분석을 통해 M2 극화 시 증가되는 것으로 알려진 대식세포 내 알파-케토글루타르산/숙신산 비율이 요소 처리에 의해 감소됨을 확인하였다. 실제로 요소가 함께 처리된 대식세포에서 mTOR 하위 분자인 S6와 AKT (Ser473)의 인산화가 감소되어 있음을 확인하였고, 더불어 실시간 세포대사 분석기를 이용하여 해당 과정과 세포 호흡이 감소되어 있음을 관찰하였다. 반면 mTOR 억제제를 이용하여 충분히 mTOR를 저해시켰을 때에는 요소에 의한 M2 극화 억제가 추가적으로 일어나지 않음을 확인하였다. 뇌조직을 이용한 이전 연구에서 요소에 의한 mTOR 분자의carbamylation 과 mTOR 신호전달 저해를 보고한 바 있어, 대식세포에서도 요소에 의한 mTOR carbamylation이 발생하는지 분석해보았으나 요소에 의한 명확한 mTOR carbamylation 증가를 확인할 수는 없었다. 대식세포뿐만 아니라 CD8+ T 세포에서도 요소는 mTOR 신호전달 및 해당 과정을 저해시켰다. 또한 세포 실험과 OT-1 세포를 이용한 동물 실험에서 요소는 CD8+ T 세포의 활성 및 증식을 모두 감소시켰다. 따라서, 요소는 mTOR 신호 저해를 통해 T 세포의 기능 이상 또한 유발하는 것으로 생각된다.
