Glioblastoma (GBM) is a refractory malignant brain tumor with high invasiveness and recurrence. To elucidate the pathogenesis of invasive GBM and evaluate treatment strategies, it is necessary to observe the three-dimensional invasion process of the tumor and its interaction with surrounding tissues in three dimensions at the cellular level or below in animal models. Tissue clearing and tissue expansion methods, which have been rapidly developed in the past decade, have made it possible to investigate three-dimensional large-scale morphologies and analyze micro-/nano-structures in existing animal models of brain diseases, respectively. However, despite researchers’ demands for these techniques to investigate tumor tissues, it has been difficult to apply them to tumor tissue due to the mechanochemical properties that differ from normal tissue.
In this study, I attempted to develop tissue clearing and tissue expansion techniques suitable for application to an invasive mouse GBM model using hydrogel and chemical engineering approaches that changed the mechanochemical properties of tumor tissue. I revealed that the hybridization method controlling the chemical interaction between the hydrogel and tissue, which I termed controlled hybridization (cHyb), exhibited superior fluorescence preservation compared to the conventional hydrogel–tissue hybridization method with uncontrolled chemical interaction. By combining this hybridization method with the existing non-ionic surfactant-based tissue clearing technique, a new tissue clearing platform that satisfied all of fluorescence preservation, discoloration, and structural preservation was developed. I demonstrated a three-dimensional investigation of tumor invasion on a large scale using the new platform. I found that three-dimensional tumor micro/nano-environment analysis, such as glutamatergic interaction between the synapse and the invading GBM cell, was possible through the combination of N-hydroxysuccinimide chemical staining and tissue expansion using physical hybridization. Notably, a new buffer designed for deep tissue chemical staining resolved the issue with the original protocol, preventing tissue expansion. Finally, the developed tissue clearing and tissue expansion methods were combined and applied to a GBM model, thereby establishing a three-dimensional, multiscale tumor microenvironment analysis platform. I expect that various information obtained through the three-dimensional multi-scale tumor microenvironment analysis platform of the invasive GBM model will facilitate elucidating the pathological mechanisms of GBM invasion and establishing a treatment strategy.
교모세포종은 침습과 재발을 잘하는 난치성 악성 뇌종양이다. 침습 교모세포종의 병리기전을 밝히고 치료 전략을 평가하기 위해서는 동물 모델에서 종양의 입체적 침습 과정 및 주변 조직과의 상호작용을 세포 수준 또는 그 이하에서 3차원적으로 관찰할 수 있어야 한다. 최근 전해온 조직 투명화와 조직 팽창술은 기존 뇌질환 동물 모델에서 각각 3차원 대단위 구조 이미징과 초미세구조 분석을 가능하게 만들었다. 하지만, 개체마다 상이하고 불균일한 종양조직은 이러한 조직공학적 영상화 기술들이 가장 효과적으로 활용될 수 있는 대상임에도 불구하고 정상조직과의 기계 화학적 특성의 차이 때문에 단순 적용이 힘들어 적용된 예가 극히 드물다.
본 연구에서는 하이드로겔과 화학공학 기술을 이용해 기계 화학적 특성을 조절하고 침습 교모세포종 모델에 적합한 조직 투명화와 조직 팽창술을 개발하고자 하였다. 먼저 융합반응 제어 하이드로겔-조직 복합체 형성 방법이 기존의 화학결합 기반 하이드로겔-조직 복합체 형성 방법에 비해 우수한 형광 보존을 나타낸 다는 것을 밝혔다. 이를 기존의 비이온 계면활성제 기반 조직 투명화 기술과의 결합을 통해 형광 보존, 탈색, 구조 보존 모두를 만족하는 새로운 조직 투명화 플랫폼을 개발하였으며, 이 플랫폼을 활용하여 침습 교모세포종의 대단위 침습 형태의 3차원 분석을 성공적으로 시행하였다. 또한 형광현미경 상에서 종양미세환경의 구조 변화의 관찰을 위해 팽창성 하이드로겔과 조직의 물리적 결합을 이용한 조직 팽창술에 화학 염색의 결합 방법을 적용하였다. 여기에 기존 심부조직 화학염색 용액에서 조직 팽창이 제한되는 문제를 해결한 새로운 심부조직 화학염색 용액 조성을 사용하는 플랫폼을 개발하여, 종양의 3차원 초미세 구조의 분석이 가능함을 밝혔다. 최종적으로 앞서 개발한 조직 투명화와 조직 팽창술 플랫폼을 결합하여 교모세포종 모델에 적용하였으며, 이를 통해 3차원 다중 스케일 종양미세환경 분석 플랫폼을 확립하였다. 침습 교모세포종 모델의 3차원 다중 스케일 종양미세환경 분석을 통해 얻어내는 다양한 정보들을 활용해서 종양 침습의 병리기전을 밝히고 치료 전략을 수립하는데 도움이 될 것으로 기대한다.
