It is difficult to comprehend the dynamic changes in gene expression that occur during the brain development. Abnormal gene expression during the brain development can lead to neurodevelopmental disorders (NDD) such as Autism Spectrum Disorder (ASD), which is the most representative NDD. However, the etiology of ASD is complicated that make it hard to identify target genes or signaling pathways to treat ASD patients. The study of sporadic syndromes with single gene mutations may reveal common signaling pathways that can be applied to interpret molecular mechanisms of ASD. ARGONAUTE 1 (AGO1) is known as one of the risk genes for ASD. However, the effects of AGO1 variations on the pathogenesis of ASD as well as the biological roles of AGO1 in brain development are not investigated yet. Here, I report that AGO1 controls cortex development by regulating cell adhesion molecules, such as REELIN. AGO1 binds to the promoter of LIN28A and down regulates expression of LIN28A at the transcriptional level. LIN28A suppresses REELIN expression at the posttranscriptional level. First, I validated that Ago1 knock-out (KO) could be a good model of ASD by showing the hypo-sociability of Ago1 KO mice in the brain. Then I confirmed the requirement of AGO1 in early brain development by using AGO1 KO human embryonic stem cells (ESCs), which are produced by CRISPR/Cas9 system. I identified disorganized cortical patches (~47%) in AGO1 KO forebrain organoids. To demonstrate the phenotype, total RNA-sequencing and Chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) were performed using neural progenitor cells (NPCs) and neurons, and I found that AGO1 regulate REELIN expression through LIN28A. AGO1 can bind to the promoter region of LIN28A and downregulate LIN28A mRNA expression at the transcriptional level in NPCs. In AGO1 KO NPCs, while the expression level of LIN28A mRNA increased, the expression level of REELIN mRNA decreased remarkably. I confirmed that REELIN mRNA expression is decreased when LIN28A is overexpressed in NPCs. REELIN mRNA is destabilized fast in AGO1 KO NPCs when the decay rate of remaining REELIN mRNA was measured after blocking the transcription process, indicating that LIN28A regulate REELIN mRNA at the post-transcriptional level. It demonstrates that REELIN mRNA decay proceeds rapidly in AGO1 KO NPCs in which LIN28A is excessively present. Finally, I showed that the recombinant human REELIN proteins can rescue the structural defects in the developing brain caused by AGO1 KO. The human REELIN recombinant protein can restored abnormal tight junction circularity in AGO1 KO neural rosettes similar to the control group. Collectively, my data show that AGO1 regulating REELIN via LIN28A is an essential factor to shape the brain architecture in early development.
인간의 뇌 발달과정을 이해하는 것은 매우 중요한 일이지만 발달과정 중 복잡하고 동시다발적으로 발생하는 역동적인 유전자의 상호작용 및 발현량 변화를 이해하기는 어려운 일이다. 정상적인 뇌 발달과정 중 초기 단계에 비정상적인 유전자 발현은 발달 장애로 이어질 수 있으며, 현대사회에서 자폐 스펙트럼 장애는 가장 대표적인 발달장애이다. 자폐 스펙트럼 장애의 다인성 복합질환적 특징은 시기적절한 진단과 치료를 어렵게 만든다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법 중 하나는 드물지만 특정한 유전자의 돌연변이로 발생하는 자폐에 대한 연구일 것이다. 본 학위 논문 주제에서 주요하게 다루는 AGO1은 변이가 발생하는 경우 자폐를 일으키는 유전자 중 하나로 알려져 있지만 AGO1의 변이가 어떻게 자폐 발병에 기여하는지 알려진 바 없다. 또한 신경발달과정에서의 AGO1이 가지고 있는 기본적인 생물학적 역할에 관해서도 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 신경세포 특이적으로 AGO1 결손을 유도하였을 때 생쥐의 사회적 상호작용 기능이 저하되는 것을 확인하였다. 사회적 상호작용 장애는 자폐 스펙트럼 장애에서 나타나는 대표적인 현상으로 자폐 스펙트럼 장애 진단에 기준으로 사용되는 주요 표현형이다. 크리스퍼 유전자 편집(CRISPR/Cas9) 시스템을 이용해 AGO1의 결손을 유도한 후 전뇌 피질 오가노이드(forebrain organoid)를 생성한 결과 흥미롭게도 AGO1 결핍 뇌 오가노이드에서 대뇌피질층의 형성에 문제가 나타남을 확인하였다. 이와 같은 표현형이 발생하는 분자 기전을 규명하기 위하여 AGO1 결핍 신경 전구세포(neural progenitor cells)와 4주간 분화 시킨 신경세포의 전사체를 분석한 결과 세포 사이 결합 유전자들의 발현이 크게 변화함을 확인하였다. 특히 신경 전구세포 단계에서 REELIN의 발현이 가장 큰 폭으로 감소함을 알 수 있었다. 또한, AGO1 염색질면역침전 시퀀싱(Chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)을 통해 AGO1이 신경 전구세포에서 LIN28A의 5’ 앞쪽 부근의 염색체에 결합할 수 있음을 확인하였는데, LIN28A mRNA 발현량 분석 결과 AGO1은 LIN28A의 발현을 감소시키는 것으로 판단된다. LIN28A의 과발현을 통해 REELIN mRNA 발현량 감소를 확인함으로써 REELIN mRNA 발현량 변화는 LIN28A 의존적임을 알게 되었다. 그리고 LIN28A 의존적 REELIN mRNA 발현량 감소가 전사 후 조절 단계에서 발생할 가능성을 actinomycin D 처리를 통해 전사과정을 막고 남아있는 REELIN mRNA의 분해속도를 측정하여 확인하였다. 그 결과 LIN28A가 과도하게 존재하는 AGO1 결핍 신경 전구세포에서 REELIN mRNA 분해가 빠르게 진행되는 것을 검증할 수 있었다. 마지막으로 AGO1 결핍 신경 로제트(rosette)에 인간 REELIN 재조합 단백질을 추가하여 배양함으로써 신경 로제트의 밀착 연접(tight junction)의 변형된 원형 구조가 대조군만큼 회복을 됨을 확인하였다. 본 연구 결과를 통해, AGO1이 LIN28A를 전사 단계에서 조절하고, LIN28A이 REELIN을 전사 후 단계에서 조절함으로써 초기 신경발생에서 뇌 구조의 형성에 관여할 수 있음을 보고하는 바이다.
