One of the hallmarks of cancer cells is their ability to evade apoptosis, which confers survival advantages and resistance to anti-cancer drugs. Cancers often exhibit overexpression of anti-apoptotic BCL-2 proteins, the loss of which triggers apoptosis. In particular, the inhibition of both BCL-xL and MCL-1, but neither one individually, synergistically enhances apoptotic cell death. Here, we report computational design to produce a protein that inhibits both BCL-xL and MCL-1 simultaneously. To a reported artificial three-helix bundle whose second helix was designed to bind MCL-1, we added a fourth helix and designed it to bind BCL-xL. After structural validation of the design and further structure-based sequence design, we produced a dual-binding protein that interacts with both BCL-xL and MCL-1 with apparent dissociation constants of 820 pM and 196 pM, respectively. Expression of this dual binder in a subset of cancer cells induced apoptotic cell death at levels significantly higher than those induced by the pro-apoptotic BIM protein. With a genetic fusion of a mitochondria-targeting sequence or the BH3 sequence of BIM, the activity of the dual binder was enhanced even further. These data suggest that targeted delivery of this dual binder alone or as a part of a modular protein to cancers in the form of protein, mRNA, or DNA may be an effective way to induce cancer cell apoptosis.
암세포의 전형적인 특징들 중 하나는 세포사멸을 회피하는 능력의 획득이다. 이 능력을 획득하는 방법의 하나로 암세포들은 항-세포사멸 BCL-2 단백질들의 발현을 증가시키는 경우가 많다. 특히, 항-세포사멸 BCL-2 단백질들 중 BCL-xL 과 MCL-1 은 여러 암세포에서 동시에 과발현 되는 경우가 많으며, 따라서 이 중에 하나만 억제한다면 큰 효과가 없지만, 두 단백질 모두를 억제하면 상승적인 세포사멸 효과를 보여준다는 보고가 많다. 이러한 정보를 바탕으로 본 연구에서 BCL-xL 과 MCL-1 을 동시에 억제하는 단백질을 계산적 디자인으로 창출하였다. 두번째 나선이 이미 MCL-1 과 결합한다고 보고된 삼중-나선 다발에, 네번째 나선을 추가하여 BCL-xL 과 결합하도록 디자인 하였다. 디자인된 단백질의 구조결정과 구조기반 서열 디자인을 추가적으로 한 후 BCL-xL 과 MCL-1 에 각각 820 pM 과 196 pM 해리상수로 결합하는 이중결합 단백질을 만들었다. 몇몇 암세포에서 이 이중결합체를 발현하면 세포에 내재하는 친-세포사멸 BIM 단백질에 의한 것 보다 강력하게 세포사멸을 유발하였다. 디자인된 단백질에 미토콘드리아 표적서열 또는 BIM 단백질의 BH3 서열을 유전자 융합하면, 세포사멸 능력은 더욱 향상되었다. 이러한 데이터들은 이 이중결합체가 단독 혹은 모듈 단백질 일부로써 사용될 수 있으며 단백질, mRNA, 또는 DNA 의 형태로 암세포에 선택적으로 전달되면 이는 암세포의 사멸을 일으킬 수 있음을 시사한다.
