Streptomyces, the largest genus of actinobacteria, has received great attention as an industrial producer of secondary metabolites, exhibiting a broad range of pharmaceutical bioactivities, such as antimicrobial, antifungal, anticancer and immunosuppressive activities. Streptomyces is also promising producers of many bio-sustainable secondary metabolites that can be used as bioherbicides, biosurfactants, vitamins, pigments, nematocides, insecticides, and agrochemicals to combat pests and parasites. Such secondary metabolites are typically synthesized via a multi-step conversion of precursor molecules, such as CoA pool and amino acids, by multi-enzyme complexes encoded in secondary metabolite biosynthetic gene clusters (BGCs). On an average, one Streptomyces strain possesses >30 different BGCs in its genome. However, their genetic potential has been poorly studied because many BGCs are not activated under standard culture conditions. Moreover, the BGCs are tightly controlled by complex regulatory systems at transcriptional and translational levels to effectively utilize precursors that are supplied by primary metabolism. Determining transcriptional and translational regulatory elements in GC-rich Streptomyces genomes is essential to elucidating the complex regulatory networks that govern secondary metabolite biosynthetic gene cluster (BGC) expression. However, information about such regulatory elements has been limited for Streptomyces genomes. To overcome this limitation, I harnessed systems biology to elucidate multi-level regulation of gene expression in Streptomyces genomes by integration of multi-omics data including Genome-Seq, RNA-Seq, Ribosome profiling, dRNA-Seq, and TermSeq, providing the comprehensive understanding of the primary to secondary metabolisms in Streptomyces for the rational design of Streptomyces engineering. First, the genome-wide regulatory elements on transcription initiation in Streptomyces were systematically analyzed by integration of Genome-Seq, RNA-Seq, and dRNA-Seq. I obtained a high-quality genome sequence of β-lactam antibiotic producer Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 by integration of Illumina short reads and PacBio long reads genome sequencing, and 58 potential BGCs were predicted based on the genome information. Then, the functional enrichment of differential expressed genes during growth in S. clavuligerus and model strain Streptomyces griseus NBRC 13350 was demonstrated from transcriptomic data. Using dRNA-Seq, the genome-scale TSSs of S. clavuligerus and S. griseus was precisely determined. Based on the TSS information, the potential regulons of sigma(σ) factors and transcription factors of S. griseus and S. clavuligerus affecting the differential transcription pattern during growth were elucidated, including β-lactam biosynthesis. This information will improve the understanding of complex transcription regulatory networks in Streptomyces BGCs. Second, the genome-wide regulatory elements on transcription termination and posttranscriptional processing in Streptomyces were systematically analyzed by integration of RNA-Seq, dRNA-Seq, and Term-Seq. I determined the genome-wide transcription 3’-end positions (TEPs), transcription units (TUs), and transcription unit clusters (TUCs) in S. clavuligerus and S. griseus. Then, unique structural and regulatory features of TEPs in Streptomyces were elucidated. TU architecture showed that the transcript abundance in TU isoforms of a TUC was potentially affected by the sequence context of their TEPs, suggesting that the regulatory elements of TEPs could control the transcription level in additional layers. In particular, potential regulatory elements located in the middle of the polycistronic operon of hopanoid BGC of S. griseus and the potential regulatory transcription unit XRE-DUF397 of S. clavuligerus were investigated. These findings highlight the role of transcriptional regulatory elements in transcription termination and post-transcriptional processing in Streptomyces. Third, the genome-wide regulatory elements on translation in Streptomyces were systematically analyzed by integration of ribosome profiling and other multi-omics data. Ribosome profiling data corrects mis-annotation of open reading frames. Then, I investigated the dynamic translational landscape during growth, revealing the translational buffering at the later growth phases. The regulatory elements on translational initiation level encoded in the 5-UTR was elucidated including the abundant leaderless mRNA and RNA structures. The regulatory elements on translation elongation level encoded in the CDS was also elucidated related to the ribosome pausing by different codon usage. Understanding of the translational features of Streptomyces will provide the potential engineering targets for the secondary metabolite production. Fourth, the primary to secondary metabolisms of the seven Streptomyces strains including model strain Streptomyces coelicolor A3(2), avermectin producer Streptomyces avermitilis MA-4680, S. griseus, S. clavuligerus, model strain Streptomyces lividans TK24, pikromycin producer S. venezuelae ATCC15439, and FK506 producer S. tsukubaensis NRRL 18488 were comparatively analyzed for the comprehensive understanding of the dynamic regulations. I constructed pan-reactome of these strains, and integrate the multi-omics (dRNA-Seq, RNA-Seq, Term-Seq, Ribosome profiling) information to elucidate the potential regulatory elements governing the transcriptome change of the hopene biosynthesis pathway. Systematic analysis of this study will provide not only the pipeline of comprehensive analysis of the pan-reactome of the secondary metabolisms, but also the foundation of the synthetic design of the precursor biosynthetic modules for the specialized chassis libraries of BGC heterologous expressions. Overall, systems biology to elucidate multi-level regulation of gene expression in Streptomyces genomes provides the regulatory elements, potential genetic expression parts, engineering targets, and the design principle of precursor biosynthetic modules for the further rational engineering to improve the secondary metabolite productions and to discover novel secondary metabolites.
Actinobacteria 문의 가장 큰 속인 방선균(Streptomyces)은 항생제, 항진균제, 항암제, 면역억제제 등 넓은 범위의 의약활성을 가지는 다양한 이차대사산물을 생산하는 산업 균주로써 주목받아왔다. 방선균은 또한 제초제, 생물계면활성제, 비타민, 색소, 살선충제, 살충제, 방제를 위한 농약 등 다양한 지속가능한 바이오물질을 생산할 수 있는 균주이다. 이러한 이차대사산물은 보통 CoA, 아미노산과 같은 전구체 물질이 이차대사산물 유전자 클러스터(BGC)에 암호화된 멀티-효소 복합체에 의한 다단계 전환 과정을 거쳐서 만들어진다. 평균적으로 하나의 방선균 종의 유전체 당 30개 이상의 서로 다른 이차대사산물 유전자 클러스터들이 존재한다. 그러나 이들 대부분은 일반적인 배양 조건에서 발현이 되지 않기 때문에 이들의 유전적인 잠재성에 대한 연구는 매우 부족한 상황이다. 또한, 이차대사산물 유전자 클러스터 발현은 전사 및 번역 수준에서 복잡한 조절 시스템에 의해 일차 대사산물로부터 생성된 전구체를 효율적으로 사용하도록 정밀 조절된다. GC 비율이 높은 방선균 유전체에서 이러한 전사 및 번역 조절 요소를 결정하는 것은 이차대사산물 유전자 클러스터 발현에 관여하는 복잡한 조절 네트워크를 밝히는데 필수적이다. 하지만 그러한 방선균의 조절 요소에 대한 정보가 부족한 실정이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 본 연구에서는 유전체 시퀀싱(Genome-Seq), 전사체 시퀀싱(RNA-Seq), 번역체 시퀀싱(Ribosome profiling), 전사시작점 시퀀싱(dRNA-Seq), 그리고 전사종결점 시퀀싱(Term-Seq)을 융합하여 방선균 유전체 내에서 유전자 발현을 조절하는 여러 수준의 조절 요소들을 밝혔다. 이를 통해 방선균의 합리적인 방선균 엔지니어링 디자인을 위한 일차대사부터 이차대사경로까지의 복합적인 이해를 할 수 있었다. 첫번째로, 방선균의 전사 개시 수준의 조절 요소를 유전체 수준으로 분석하였다. β-lactam 계열 항생제 생산 균주인 Streptomyces clavuligerus ATCC 27064의 고품질 유전체 서열을 두 유전체 시퀀싱 방법을 융합하여 완성하였고, 이를 기반으로 58개의 이차대사산물 유전자 클러스터를 예측하였다. 그리고, S. clavuligerus 와 모델 균주인 Streptomyces griseus NBRC 13350에 대해 전사체 분석을 통하여 생장과정 동안 다르게 발현되는 유전자들의 기능을 분석했다. 또한 dRNA-seq을 이용하여 전사 시작점을 정확히 결정하였고, 이를 기반으로 시그마 인자와 전사 인자의 잠재적 조절군을 발굴하였고, 이것이 β-lactam 계열 항생제 생산 경로를 포함하여 생장과정 동안 다르게 발현되는 유전자들에 역할을 함을 보였다. 이 정보는 방선균 이차대사산물 유전자 클러스터에 작용하는 전사 조절 시스템에 대한 이해 수준을 높일 것이다. 두번째로, 방선균의 전사 종결 및 전사 후 수정 수준의 조절 요소를 유전체 수준으로 분석하였다. Term-Seq 데이터와 다른 멀티 오믹스를 융합하여 전사체 3’말단 지점, 전사 유닛, 그리고 전사 유닛 클러스터를 S. clavuligerus와 S. griseus에서 유전체 수준으로 결정했다. 이를 통해 방선균 전사체 3’말단 지점의 독특한 구조적, 조절적인 특징을 밝혔다. 그리고 전사 유닛 분석을 통해 전사 유닛 클러스터 내의 유사 전사 유닛들이 전사체 3’말단 지점의 특징에 의해 조절되어 그것이 발현양을 다른 수준에서 조절하는 조절요소임을 밝혔다. 특히, S. clavuligerus XRE-DUF397 전사 유닛에 대한 잠재적 조절 요소와 S. griseus Hopene BGC의 전사 유닛 중간에 존재하는 잠재적 조절 요소에 대한 분석을 진행했다. 해당 연구는 방선균에서 전사 종결 및 전사 후 수정 수준의 조절 요소의 역할이 중요함을 보였다. 세번째로, 방선균의 번역 수준의 조절 요소를 유전체 수준으로 분석하였다. Ribosome profiling 데이터를 통해 잘못된 유전자 주석을 수정할 수 있었다. 또한 Ribosome profiling 데이터와 다른 멀티 오믹스를 융합하여 생장 과정 동안 다양하게 변화하는 번역체를 분석하여, 후기 생장기에서 번역 버퍼링이 존재함을 밝혔다. 또한 leaderless mRNA와 RNA 구조와 관련된, 5’UTR에 존재하는 번역 개시 수준의 조절요소를 밝혔다. 이에 더해 코딩 서열에 존재하는 코돈 종류에 따라 다른 리보좀 멈춤 현상에 관련된 번역 신장 수준의 조절요소를 밝혔다. 이러한 방선균의 번역 관련 특징은 이차대사산물 생산을 위한 잠재적인 엔지니어링 포인트로써 작용할 수 있을 것이다. 네번째로, 모델 균주 Streptomyces coelicolor A3(2), avermectin 생산 균주 Streptomyces avermitilis MA-4680, S. griseus, S. clavuligerus, 모델 균주 Streptomyces lividans TK24, pikromycin 생산 균주 S. venezuelae ATCC15439, FK506 생산 균주 S. tsukubaensis NRRL 18488, 이렇게 7종의 방선균에 대해서 일차대사부터 이차대사까지의 일련의 유전자 발현 양상을 비교분석하여 다양하게 변화하는 발현조절을 복합적으로 이해하고자 했다. 먼저 7종의 판-리액톰을 구축하고, 이에 멀티오믹스 정보를 융합하여 hopene 생산 과정에서의 전사체 변화에 관여하는 잠재적 조절 요소를 밝혔다. 본 연구에서의 시스템 수준 분석은 이차대사의 판-리액톰에 대한 복합적 분석의 파이프라인을 제시할 뿐만 아니라 섀시 균주 라이브러리에서의 이차대사산물 생산 유전자 클러스터 이종발현을 위한 전구체 생산 모듈 디자인의 기초를 정립하는데도 도움을 줄 것으로 기대된다. 전반적으로 요약하자면, 방선균 유전체 내의 유전자들의 다양한 수준에서의 조절을 시스템 생물학을 이용해 밝혔고, 이는 조절 요소들, 잠재적인 유전자 발현 파트, 엔지니어링 타겟, 전구체 생산 모듈 디자인 원리를 제공하여 추후 이차대사산물 생산 증대 혹은 새로운 이차대사산물 발굴을 위한 합리적 엔지니어링에 도움이 될 것으로 기대된다.
