The early regulators involved in initiating endothelial cell transcription factors expression remains to be elucidated. Here, I profiled the expression dynamics of transcription factors involved in endothelial cell specification from human embryonic stem cells. Through intensive mRNA-Seq, the expression characteristics of several classes of immediate early genes, such as FOS, JUN, EGR family, NR4A family and NPAS family at an early stage of endothelial cell differentiation was visualized. Our results showed that NPAS4, a homolog of npas4l exhibit immediate response upon VEGF-A stimuli. Through CRISPR/Cas9 genome editing and Tet-3G Cas9 inducible expression system, NPAS4 knockout and inducible Cas9 hESCs lines was generated, aiming to study role and mechanism of hHLH-PAS family members in endothelial cell specification under VEGF-A signaling. The results showed that NPAS4 depletion does not affect endothelial cell differentiation. HIF1A and AHR inducible knockout was not efficient. The role of Hippo pathway in tissue hemostasis has been well stated, its function in the onset developmental stage of vascular system has not been studied. In vitro self-assembled vascular organoid derived from hESCs provide opportunity to study the role of Hippo pathway either in early development stage or in pathologic condition. Through dual-gRNA mediated CRISPR/Cas9 system, YAP1 inducible knockout hESCs line was generated. Vascular organoid with vasculature structure was generated. These resources can be used for further mechanism study related to Hippo signaling pathway.
혈관 내피 세포 분화에 관여하는 전사 인자를 발현하는데 연관된 초기 인자들은 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 우리는 인간 배아 줄기 세포에서 혈관 내피 세포로 분화하는데 관여하는 전사 인자들의 발현 패턴을 프로파일링 하였다. 인텐시브한 mRNA-seq 실험을 통해, FOS, JUN, EGR family, NR4A family 및 NPAS family와 같은 유전자들의 혈관 내피 세포 분화 초기 유전자 발현 특성을 분석하였다. 우리의 결과는 npas4l의 상동체인 NPAS4가 VEGF-A 자극에 즉각적인 반응을 나타낸다는 것을 보여주었다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술과 Tet-3G Cas9 유도성 발현 시스템을 통해, VEGF-A 신호로 인한 혈관 내피 세포 분화에 관여하는 hHLH-PAS 패밀리 구성원의 역할을 연구하기 위해 NPAS4 knockout 및 유도 가능 Cas9-배아 줄기 세포주를 확립하였다. 이 실험에 대한 결과는 NPAS4 결핍이 혈관 내피 세포 분화에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다. 또한 HIF1A 및 AHR 유도성 녹아웃 역시 효율적으로 영향을 주지 못하였다. 조직의 항상성에서 Hippo 시그널링의 역할을 잘 알려져 있지만, 혈관계 발달에서의 기능은 아직 연구되지 않았다. 배아 줄기세포에서 파생된 in vitro 자가 형성 혈관계 오가노이드는 초기 발달 및 병리학적 상태에서의 Hippo 시그널링의 역할을 연구할 수 있는 기회를 제공한다. 이중 가이드 RNA로 매개된 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 YAP1 유도성 녹아웃 배아줄기 세포주를 확립하였다. 그리고 혈관 구조를 가진 혈관계 오가노이드를 제작하였다. 이러한 자원은 Hippo 신호 전달 경로와 관련된 추가 메커니즘 연구에 사용될 수 있다.
