This thesis describes elemental technologies and fully automated molecular diagnostics by utilizing a centrifugal microfluidic system. As the elemental technologies, a vertically-configured laser-irradiated ferrowax microvalve system was developed to have a compact structure and utilized it for the automated serial dilutions of the sample. Besides, a high-temperature ferrowax microvalve system was also developed for the valve-operation under the isothermal DNA amplification process. The optimal plano-convex collimating lens structure was designed by optical simulation and adapted to the injection-molded disc to amplify the fluorescence signal. A one-step centrifugal step emulsification method was developed that can be useful for digital quantitative analysis. Based on these elemental technologies, the centrifugal microfluidics-based standard quantitative analysis methods were automated. This allows the process of the standard addition analysis and external standard analysis to be carried out easily in a very short time while providing more accurate quantitative information. Finally, I integrate all the processes for molecular diagnostics, including DNA extraction and purification, isothermal DNA amplification, and fluorometric detection in a single disc. I targeted three kinds of major foodborne pathogens (Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, and Listeria monocytogenes), and isothermal target and probe amplification (iTPA) was performed to amplify the specific sites of the target genes. Samples contaminated with foodborne pathogens could be automatically analyzed by the rotor system down to the dozens of CFU levels in 90 min. Besides, the presence of tuberculosis germs while also determining the resistance of major anti-tuberculosis drugs through single nucleotide polymorphism (SNP) analysis for the multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) diagnostics. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with cycling probe technology (CPT) was performed to discriminate the mutations of the target genes about drug-resistance of the rifampicin and isoniazid drugs. The simplicity and portability of the centrifugal microfluidics can provide an advanced platform for quantitative analysis and point-of-care testing, and can be effectively applied to the resource-limited environment.
본 학위논문은 원심력 기반 microfluidic system의 요소 기술 개발과 표준분석법 자동화, 그리고 바이오센서 구현에 관해 다루고 있다. 요소 기술로써 기존 ferrowax 기반 microvalve system을 개선하여 매우 작게 구현하였고, 이를 serial dilution에 적용해 자동화하였다. 또한 고온 구동에 적합하도록 새로운 재질의 ferrowax를 도입하였다. 광학 시뮬레이션을 통해 reaction chamber 하부에 들어갈 집광 렌즈 구조를 최적화하였고, 이를 실제 디스크에 도입하여 측정되는 광학 신호를 증폭시킬 수 있었다. 또한 디지털 정량분석을 위해 한 단계로 균일한 미세방울을 형성하는 기법을 개발하였다. 다양한 기반 기술들을 활용하여, 표준 정량분석법을 자동화시킬 수 있었다. 이렇게 자동화된 표준물 첨가법과 외부표준법을 활용하여 다양한 화학물질과 바이오물질을 정량할 수 있었다. 마지막으로 분자진단에 적용하여 자동화된 분석을 수행할 수 있는 전자동 분석 플랫폼을 개발하였다. 분자진단을 위한 샘플 전처리 및 등온 핵산 증폭, 검출 과정이 단일 디스크 내에 모두 통합되었고, 3종의 주요 식중독균 (Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, and Listeria monocytogenes)을 검출에 활용될 수 있었다. 등온 핵산 증폭 과정으로는 Isothermal target and probe amplification (iTPA)을 활용하였으며, 분리된 개별 챔버에 각각 다른 타겟에 대한 primer set을 넣어주어 단일 채널만을 가지고 상호 간의 방해요소 없이 다중 검출을 수행할 수 있었다. 이를 통해 오염된 샘플로부터 수~수십 CFU 수준의 균을 90분 이내에 검출해낼 수 있었다. 결핵균을 검출함과 동시에 단일염기변이(Single nucleotide polymorphism, SNP) 분석을 통해 주요 항결핵 약제의 내성을 확인하는 방법도 연구하였다. 이 과정은 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)를 이용한 등온 핵산 증폭에 cycling probe technology (PCT) 과정을 결합하여 수행되었으며, 주요 항결핵약제인 리팜핀(rifampicin)과 아이나(isoniazid)의 내성 여부를 매우 민감하게 판별할 수 있음을 확인하였다. 이러한 원심력 기반 microfluidic system은 매우 간단하고 휴대성이 높아 현장 진단에 매우 적합하며, 제한된 환경에서도 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
