Human cell lines, such as human embryonic kidney (HEK) 293, HT-1080, and PER.C6 have been used for the production of therapeutic proteins because of human-like post-translational modifications (PTMs), thereby ensuring proper function of recombinant proteins and eliminating the risk of immunogenic reactions. A traditional strategy for cell line development has been dependent on the random integration of gene-of-interest (GOI), which is often leading to instability of genetic and production profiles of recombinant cell lines. To overcome the drawbacks of random integration, site-specific integration of GOIs has been attempted in mammalian cell lines, including Chinese hamster ovary (CHO) and HEK293 cells. Most notably, a platform using recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) coupled with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) allows for the facile generation of recombinant cell lines producing therapeutic proteins. In this study, human genomic safe harbors (GSHs) were assessed and compared for the establishment of human cell-based RMCE platform. Then, various therapeutic proteins, erythropoietin, Fc-fusion proteins, monoclonal antibodies (mAbs), and coagulation factor Ⅷ, were produced in recombinant cells using this platform. Dual-landing pad cell lines were generated and RMCE system was optimized to facilitate the development of recombinant cells stably expressing multigene cassettes at safe harbors. Finally, RMCE-based CRISPR/Cas9 library screening platform was established in HEK293 cells, and novel target genes were identified from the osmotic stress screening, enabling the generation of stress-resistant human cells for improved productivity of therapeutic proteins.
Comprehensive analysis of target sites for transgene expression is necessary for the establishment of cell line development platform based on site-specific integration. Human cell lines are being increasingly used as host cells to produce therapeutic glycoproteins, due to their human glycosylation machinery. In an attempt to develop a platform for generating isogenic human cell lines producing therapeutic proteins based on targeted integration, three well-known human GSHs – AAVS1, CCR5, and human ROSA26 loci – were evaluated with respect to the transgene expression level and stability in HEK293 cells. Among the three GSHs, the AAVS1 locus showed the highest eGFP expression with the highest homogeneity. Transgene expression at the AAVS1 locus was sustained without selection for approximately 3 months. Furthermore, the CMV promoter showed the highest expression, followed by the EF1α, SV40, and TK promoters at the AAVS1 locus. Master cell lines were created using CRISPR/Cas9-mediated integration of the landing pad into the AAVS1 locus and were used for faster generation of recombinant cell lines that produce therapeutic proteins with RMCE.
A platform, based on targeted integration of transgenes using RMCE coupled with CRISPR/Cas9, is increasingly being used for the development of mammalian cell lines that produce therapeutic proteins, because of reduced clonal variation and predictable transgene expression. However, low efficiency of the RMCE process has hampered its application in multicopy or multisite integration of transgenes. To improve RMCE efficiency, nuclear transport of RMCE components such as site-specific recombinase and donor plasmid was accelerated by incorporation of nuclear localization signal and DNA nuclear-targeting sequence, respectively. Consequently, the efficiency of RMCE in dual-landing pad HEK293 cell lines harboring identical or orthogonal pairs of recombination sites at two well-known human safe harbors (AAVS1 and ROSA26 loci), increased 6.7- and 8.1-fold, respectively. This platform with enhanced RMCE efficiency enabled the integration of large gene cassettes, and simultaneous integration of transgenes at the two sites using a single transfection without performing selection and enrichment processes. The use of a homotypic dual-landing pad HEK293 cell line capable of incorporating the same transgenes at two sites resulted in a 2-fold increase in the transgene expression level compared to a single-landing pad HEK293 cell line. In addition, the use of a heterotypic dual-landing pad HEK293 cell line, which can incorporate transgenes for a recombinant protein at one site and an effector transgene for cell engineering at another site, increased recombinant protein production.
For the application of an optimized RMCE systems, we established the CRISPR/Cas9 library screening platform in HEK293 cells based on the guide RNA integration mediated by RMCE to interrogate gene functions in a high-throughput manner. During the mammalian cell culture, cellular stresses are induced by the exogenous and endogenous changes, such as temperature, pH, osmolality, metabolite concentration, and unfolded/misfolded proteins. These stresses often aggravate cell proliferation and eventually lead to cell death, thereby impeding the efficient production of recombinant proteins with proper quality in bioprocesses. Genetic engineering of endogenous genes related to stress responses has been attempted to minimize the negative effects of stress conditions; however, the elucidation of novel targets has been labor-intensive and limited to previous studies. Using RMCE-based CRISPR/Cas9 screening platform, we screened for genes whose perturbation confers the resistance to hyperosmotic stress, which inhibits cell growth and induces apoptosis. As a result, we identified human GSPT1 gene pertaining to the apoptosis, and knockout of this gene significantly increased cell growth and prolonged culture longevity, resulting in improved productivity of therapeutic proteins during the fed-batch culture.
In conclusion, the cell line development platform based on RMCE coupled with CRISPR/Cas9 has facilitated the rapid and reliable generation of recombinant cells producing various therapeutic proteins in human cells. Furthermore, the optimized RMCE process allows for the multigene expression of transgenes, thereby extending the scope of human cell engineering. Lastly, CRISPR screening platform using RMCE-mediated library integration enables the identification of novel targets associated with cellular stress, and the generation of stress-resistant producers for recombinant proteins.
Human embryonic kidney (HEK) 293, HT-1080, PER.C6 세포를 포함하는 인간 세포주는 재조합 단백질의 기능에 중요한 역할을 하는 번역 후 변형이 가능하고, 면역원성 반응의 위험을 제거하기 위한 이유로 치료용 단백질 생산에 이용되었다. 세포주를 개발하는 전통적인 방식은 발현시키고자 하는 유전자의 무작위 삽입에 의존했는데, 이는 종종 재조합 세포주의 유전적 조성과 생산적 측면에서의 불안정성을 유발했다. 이러한 무작위 삽입 방법의 단점을 극복하기 위해 위치 특이적 삽입 방식이 Chinese hamster ovary (CHO), HEK293 세포를 포함하는 다양한 동물 세포주에서 시도되었다. 특히 재조합 효소 매개 카세트 교환 방법 (RMCE)과 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 시스템이 결합된 플랫폼은 치료용 단백질을 생산하는 재조합 세포주의 개발을 용이하게 만들었다. 인간 세포 기반의 RMCE 플랫폼을 확립하기 위해, 먼저 인간 세포에서 유전적으로 안정하다고 알려진 위치들을 분석하여 비교했고, 확립된 플랫폼을 기반으로 erythropoietin, Fc 융합 단백질, 단일 클론 항체, 혈액 응고 인자 Ⅷ 등 다양한 치료용 단백질을 생산했다. 또한, 다중 유전자의 안정적인 발현을 위해 두 개의 landing pad를 갖고 있는 세포주를 개발했고, 효율적인 재조합 세포주의 개발을 위해 RMCE 시스템을 최적화했다. 마지막으로, RMCE 기반 CRISPR/Cas9 라이브러리 스크리닝 플랫폼을 HEK293 세포에서 확립했고, 이를 활용해 삼투압 스트레스 스크리닝에서 새로운 타겟 유전자를 발굴하여 스트레스 저항성과 향상된 생산성을 지닌 인간 세포를 개발했다.
위치 특이적 삽입에 기반한 세포주 개발 플랫폼을 확립하기 위해 먼저 유전자 삽입 위치에 대한 종합적인 분석을 수행했다. 인간과 유사한 당화 기능으로 인해 치료용 당단백질을 생산하기 위한 숙주로써 인간 세포주의 활용은 증가하는 추세이다. 위치 특이적 삽입을 활용하여 동일한 유전적 형질을 갖는 치료용 단백질 생산용 인간 세포주를 개발하기 위해 인간 세포에서 잘 알려진 3가지 유전적 안정 위치, AAVS1, CCR5, 그리고 ROSA26를 유전자의 발현 수준과 안정성 측면에서 평가했다. 이 중, AAVS1이 가장 높은 GFP의 발현과 균일한 발현 성향을 보였고, 이 위치에서의 유전자 발현은 선택적 압력 없이도 약 3개월 동안 유지되었다. 또한, AAVS1에서 CMV, EF1α, SV40, TK 프로모터의 순서대로 높은 GFP 발현 수준을 보였다. 앞선 결과를 기반으로 CRISPR/Cas9을 활용해 AAVS1에 landing pad를 삽입한 마스터 세포주를 개발했고, RMCE를 이용해 다양한 치료용 단백질을 생산하는 재조합 세포주를 빠르게 개발할 수 있었다.
RMCE와 CRISPR/Cas9을 기반으로 하는 플랫폼은 감소된 클론 간의 차이와 예측 가능한 유전자 발현의 장점 때문에 치료용 단백질을 생산하는 동물 세포주의 개발에 있어서 그 활용이 증가하고 있다. 그러나, 낮은 효율의 RMCE 과정은 다중 유전자 카피나 다중 위치에서의 유전자 삽입의 측면에서 그 활용을 방해하는 원인이 되었다. RMCE의 효율을 향상시키기 위해 위치 특이적 재조합 효소와 공여자 플라스미드와 같은 관련 요소들의 핵 내부 수송을 강화할 수 있는 핵 위치 신호 및 DNA 핵 표적 서열이 각각의 요소에 포함되었다. 결과적으로, AAVS1과 ROSA26 위치에 동일한 또는 다른 두 개의 landing pad를 갖는 HEK293 세포주에서 RMCE 효율이 각각 6.7 그리고 8.1배 증가했다. 증가된 효율을 기반으로 하는 이 플랫폼은 선택적 압력이나 농축 과정 없이 한 번의 형질주입으로 두 개의 위치에서 동시에 유전자 삽입을 가능하게 만들었다. 두 개의 동일한 landing pad를 갖는 마스터 세포주를 활용하여 동일한 유전자를 삽입함으로써 유전자 발현을 2배로 증가시킬 수 있었다. 또한, 두 개의 다른 landing pad를 갖는 마스터 세포주를 활용해 한 위치에서는 재조합 단백질을 생산하고, 다른 위치에서는 세포 개량을 위한 유전자를 발현함으로써 재조합 단백질의 생산성을 향상시켰다.
앞서 최적화된 RMCE 시스템을 활용하여 유전자의 기능을 동시에 대량으로 분석할 수 있는 CRISPR/Cas9 라이브러리 스크리닝 플랫폼을 HEK293 세포에서 확립했다. 동물 세포 배양 중 일어나는 온도, pH, 삼투압 몰농도, 대사 물질 농도, 그리고 단백질 구조 접힘의 오류와 같은 외인성 및 내인성 변화로 인해 세포성 스트레스가 발생할 수 있다. 이러한 스트레스는 종종 세포의 성장을 저해하고 결국에는 세포 사멸을 초래하여, 생산 과정에서 좋은 품질의 재조합 단백질을 효율적으로 생산하기 어렵게 만든다. 스트레스 반응들과 관련된 유전자를 유전적으로 개량함으로써 이러한 부정적인 효과를 최소화하기 위한 시도가 진행되었지만, 새로운 타겟의 발굴은 노동집약적이며 이전 연구들에 제한된다는 한계를 지니고 있었다. 확립된 RMCE 기반 라이브러리 스크리닝 플랫폼을 이용해 세포의 성장을 저해하고 세포 사멸을 유발하는 삼투압 스트레스에 저항성을 지니게 만드는 유전자를 스크린 했다. 결과적으로 세포 사멸과 연관된 GSPT1 유전자를 발굴했고, 이 유전자를 knockout 한 결과, 유가식 배양 과정 중에 세포 성장과 배양 기간이 유의미하게 증가하여 치료용 단백질의 생산성을 향상시켰다.
결과적으로, 본 연구에서 개발된 RMCE와 CRISPR/Cas9 기반 세포주 개발 플랫폼은 빠르고 안정적으로 다양한 치료용 단백질을 생산할 수 있는 재조합 세포의 개발을 가능하게 했다. 또한, 최적화된 RMCE 과정은 다중 유전자의 발현을 가능하게 함으로써 인간 세포 개량의 범위를 확장했다. 마지막으로, RMCE 기반 라이브러리 스크리닝 플랫폼은 세포 배양 시 발생하는 세포성 스트레스와 연관된 새로운 타겟을 발굴하도록 도와주고, 이는 스트레스에 저항성을 갖는 재조합 단백질 생산용 세포를 개발하기 위해 활용될 수 있다.
