Throughout history, Epidemics and infectious diseases had impacted the person and human society. Before the discovery of infectious bacteria and antibiotics, humans did not understand and died by various infections and epidemics caused by infectious bacteria. In the 19th century, Infectious bacteria were found as the cause of infection and epidemic, and antibiotics began to be synthesized which were dramatically increased human health and population. However, infectious bacteria getting acquired antibiotic resistance with the overuse and abuse of antibiotics for all infections. In a 2013 CDC report for antibiotic resistance, in order to respond to this increasing antibiotic resistance, I need to develop new antibiotics and to prevent abuse of antibiotics to suppress the antibiotic-resistant infection.
The abuse and overuse of antibiotics in hospitals started with the limitation of the conventional standard diagnostic method for infectious bacteria, which was time-consuming, or the opportunity of the false-positive signals. In this study, I present a more rapid and accurate diagnosis system to discriminate and detect infectious bacteria. In chapter 1, I introduce the history and diagnostics techniques of infectious disease and antibiotics. In chapter 2, colistin sulfate (polymyxin E) was used to label and diagnosis Gram-negative bacteria as a targeting ligand. Colistin is an antibiotic that forms pore on lipopolysaccharide (LPS) presented on the cell wall of Gram-negative bacteria, and the possibility of specific labeling properties on Gram-negative bacteria was confirmed through previous studies. To confirm and optimize the specific condition for diagnosis with colistin as a targeting ligand, I prepared fluorophore-conjugated colistin. The time and concentration to label Gram-negative bacteria were confirmed, and also prepared this system labeled Gram-negative bacteria specifically among various pathogens, cells, and biological components. In chapter 3, electrochemical sensors to discriminate Gram-positive and Gram-negative bacteria were assessed using colistin, as a Gram-negative specific ligand, and vancomycin, as a Gram-positive specific ligand. I synthesized and prepared antibiotic conjugated polymer dot, and coated silicon wafer with polymer dot solution to prepare electrochemical sensors. These electrochemical sensors were able to specifically identify and diagnose Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, and furthermore, clinical samples from infected patients were also distinguished precisely. In addition, antibiotic resistance bacteria were confirmed with a shorter operating time than conventional methods, such as e-test or disk diffusion method, by using additional antibiotics in labeling solution.
In chapter 4, I proposed two studies to measure antibiotic resistance via click chemistry and microfluidic channels. As a first trial, L-captopril, known as an inhibitor that blocks the active sites of NDM-1 which is a type of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE), was attempted to label NDM-1 through a biorthogonal reaction. Since L-captopril is a molecule that strongly interacts with the Zn ion in the active site of NDM-1, L-captopril derivatives (Cap-ED-TOC and Cap-PEG-TCO) were prepared to label and inhibit NDM-1. Through the inhibition of antibiotic hydrolysis of NDM-1, I confirmed the labeling of NDM-1 with L-captopril derivatives. Afterward, Tz-fluorophore was introduced to react with captopril derivatives on NDM-1, and fluorescence signal would be obtained from NDM-1. However, after the second labeling reaction, the L-captopril derivative failed to label NDM-1 and no significant fluorescence signal was obtained. As a second trial, microbeads and microfluidic channels were used to confirm the antibiotic susceptibility of infectious bacteria or to accurately measure the minimum inhibitory concentration (MIC). In this study, magnetic beads helped to capture, concentrate, and isolate infectious bacteria from clinical samples, and the bacteria were inoculated into a microfluidic channel for gradient antibiotic susceptibility testing that maintains a gradient antibiotic concentration (GAST microfluidic channel). This GAST microfluidic channel can control and maintain the distribution of antibiotics, and also can grow inoculated bacteria. By controlling the distribution of antibiotics in GSAT microfluidic channel, GSAT conducted the antibiotic susceptibility test or measure more sensitive MIC with narrow antibiotic concentration. This study intended to help enable the use of intermediated-resistance antibiotics through more sensitive MIC measurements, and expand the available antibiotics in practical use.
인류의 역사에서 감염과 전염병은 인간사회와 개인에게 큰 영향을 미치는 요소였다. 감염균과 항생제의 발견 전까지, 인류는 감염균에 의한 다양한 전염병으로 사망했고 원인을 제대로 알 수 없었다. 19세기, 감염균이 감염과 사망의 원인임을 밝혀내고 항생제를 합성하기 시작하면서 인류의 건강과 수명은 크게 증가했다. 하지만 모든 감염에 항생제를 과도하게 사용하면서, 감염균은 항생제에 대한 내성을 획득하기 시작했다. 2013년 CDC의 보고서는 이에 대응하기 위하여 새로운 항생제의 개발과 항생제 저항성의 획득을 억제하기 위한 오남용 방지 노력이 필요하다고 보고했다. 항생제의 오남용은 기존의 감염균 진단 기술의 한계와 더불어 시작된 문제이며 본 학위논문은 감염균에 대한 기존의 진단 과정을 보다 신속하고 정확하게 하는 것을 목표로 한다. 먼저 chapter 1은 감염병과 항생제의 발견, 그리고 현재 사용되는 진단법에 대해 소개하고자 한다. Chapter 2에서는 항생제를 이용한 그람음성균의 표지 및 진단을 목표로 colistin sulfate (polymyxin E)를 활용한 연구를 진행했다. Colistin 은 그람음성균의 세포벽에 존재하는 lipopolysaccharide (LPS)에 기공을 형성하여 표면에 작용하는 항생제이며, 기존의 연구를 통해 그람음성균 특이적인 표지의 가능성을 확인했다. 우리는 colistin에 형광단 conjugated를 형성하여 colistin을 이용한 진단을 최적화하고자 했다. Colistin을 사용한 표지에 필요한 시간과 농도 조건을 확인하고 다양한 병원균 중 그람음성균 특이적인 표지 및 진단의 가능성을 확인했다. 또한 그람양성균, 세포 등의 생물질이 함께 존재하는 경우에도 colistin은 그람음성균 특이적인 표지와 형광신호를 보였고, 이를 통해 우리는 colistin이 그람음성균 특이적인 진단에 적합하다는 것을 확인했다. 이어, chapter 3에서는 그람음성균 표지가 가능한 colistin 접합 폴리머닷과 그람양성균 특이적인 표지가 가능한 vancomycin 접합 폴리머닷을 이용한 전기화학기반의 센서를 개발하고 이용하여 연구를 진행했다. 전기화학센서는 그람음성균과 그람양성균 특이적으로 확인 및 진단할 수 있었고, 더 나아가 환자로부터 채취한 객담 샘플에서도 그람음성균과 그람양성균을 구분했다. 또한 고농도의 항생제 용액을 사용하여 기존의 항생제 저항성 검사보다 짧은 시간에 감염균의 항생제 저항성을 역시 확인할 수 있었다. Chapter 4에서 우리는 항생제 감수성의 측정과 정량을 목표로 두가지 연구를 제안했다. 첫 번째 시도는 카바페넴 내성 장내세균 (CRE)의 일종인 NDM-1을 생체 직교 반응으로 표지하여 얻은 신호를 통해 항생제 감수성의 정량하고자 했다. L-captopril은 NDM-1의 활성 위치의 아연이온과 강하게 상호작용하기 때문에, L-captopril 유도체 (Cap-ED-TOC와 Cap-PEG-TCO)는 NDM-1을 표지하기 위해 준비했다. 먼저 L-captopril 유도체가 항생제의 가수분해 반응을 억제하는 것을 통해, 이 물질이 NDM-1을 표지하는 것을 확인했다. 이 후 Tz-형광단을 도입하여 NDM-1에 표지된 L-captopril 유도체를 반응시켜 NDM-1에서 형광신호를 얻었다. 하지만 두번째 표지반응에서 L-captopril 유도체는 NDM-1의 형광표지에 실패했고, 유의미한 형광신호를 얻을 수 없었다. 두번째 시도는 마이크로입자와 미세유체관을 이용하여 감염균의 항생제 감수성을 확인하거나 최소억제농도 (MIC)의 정확한 측정을 목표로 했다. 자성입자는 임상 샘플에서 감염성 세균을 포획, 농축, 및 분리하기 위해 이용되었고, 항생제의 농도를 gradient하게 유지하는 gradient 항생제 감수성 테스트를 위한 미세유체관 (GAST 미세유체관)에 균을 접종하도록 도왔다. GAST 미세유체관은 항생제 농도분포를 조절할 수 있고, 이를 통해 접종된 균의 항생제 감수성을 확인하거나, 항생제 농도의 범위를 좁혀 좀 더 민감한 MIC 측정을 진행할 수 있다. 이 연구는 항생제의 농도분포를 조절함으로써 기존 진단법으로는 사용하기 어려웠던, 중간내성의 항생제들 역시 사용 가능하도록 도와 실제 진료에 도움이 되고자 한다.
