Herein, we developed a label-free method to detect ribonuclease H (RNase H) by utilizing target-triggered amplification of fluorescent light-up aptamers. In principle, this system employs an RNA/DNA chimeric hairpin promoter sequence as a detection probe for RNase H activity assay. RNase H hydrolyzes RNA strand in the detection probe, releasing T7 promoter sequence to make complete double-stranded T7 promoter. Then, T7 RNA polymerase recognizes the structure and amplify a large number of broccoli aptamer, which is a type of fluorescent light-up aptamers, and they bind to the (Z)-4-(3,5-Difluoro-4-hydroxybenzylidene)-1,2-dimethyl-1H-imidazol-5(4H)-one (DFHBI) fluorogenic dye and emit intense fluorescence signal. With this method, we successfully measured RNase H activity down to 0.000156 U/mL, with high selectivity against other nucleases and a DNA repair enzyme. Furthermore, we also demonstrated practical applicability of this strategy by successfully analyzing RNase H activity in a complex cellular extract environment.
본 학위논문에서는 표적에 의해 증폭되는 형광 발광 압타머를 이용하여 리보뉴클레이스 H의 활성을 표지 없이 검출하는 방법을 개발하였다. 본 기술은 리보뉴클레이스 H의 활성을 검출하기 위해 RNA/DNA 혼성 헤어핀 프로모터 서열을 검출 프로브로 도입하였다. 리보뉴클레이스 H는 검출 프로브의 RNA 부분을 가수분해하고, 그 결과 T7 프로모터 서열이 방출되어 이중 가닥 T7 프로모터가 만들어진다. T7 RNA 중합 효소는 이 구조를 인식하여 형광 발광 압타머인 브로콜리 압타머를 증폭시키고, 이는 형광 염료인 DFHBI와 결합하여 강한 형광 신호를 방출한다. 본 기술을 이용하여 리보뉴클레이스 H를 0.000156 U/mL의 낮은 검출한계로 검출하였으며, 다른 핵산가수분해효소 및 DNA 수선 효소와도 성공적으로 구분해 높은 선택도를 입증하였다. 또한, 복잡한 세포 용해물 환경에서도 리보뉴클레이스 H 를 안정적으로 검출함으로써 본 기술의 실용성을 증명하였다.
