Bacillus thuringiensis is a gram-positive soil bacterium that produces the insecticidal proteins during the sporulation. The insecticidal protein genes have been classified as cryⅠ, cryⅡ, cryⅢ, cryⅣ, and cryⅤ genes according to their toxic spectrums. Since the cryⅤ genes are apparently silent in B. thuringiensis strains, it is possible that some B. thuringiensis strains that do not show detectable insecticidal activity may carry cryⅤ-type genes that encode insecticidal proteins with highly specific activities. In this study, we tried to screen the cryⅤ-type genes from a number of different B. thuringiensis strains to find a novel cryⅤ-type gene that may have a new insecticidal activity spectrum.
DNA dot blot hybridizations with a cryⅤ-specific probe indicated that the cryⅤ-type genes are widely distributed in B. thuringiensis strains. Two cryⅤ-type genes, $cryⅤ_1$ and $cryⅤ_465$, were cloned from B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 and B. thuringiensis subsp. entomocidus BP465 strains respectively, and nucleotide sequences were determined. Both $cryⅤ_1$ and $cryⅤ_465$ genes were highly homologous to known cryⅤ gene. Purified inclusions of the $cryⅤ_1$ protein was toxic to Plutella xylostella and Bombyx mori, whereas the $cryⅤ_465$ protein was only toxic to P. xylostella. Toxicity of both $cryⅤ_1$ and $cryⅤ_465$ protein may prove to be useful additions to the responsible management strategy for control of P. xylostella that is resistant to commercial preparations of B. thuringiensis.
The cryⅤ-type genes have been characterized as linkage with a cryⅠ gene. We detected a cryID-like gene located approximately 0.5-kb 5' of the $cryⅤ_465$ gene, and this type of cryⅠ-cryⅤ linkage seems to be common in other cryⅤ-type genes. We also cloned a cryⅠA(a)-$cryⅠ_1$ gene linkage from. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 and a cryIE-$cryⅤ_1$ gene linkage from B. thuringiensis subsp. tolworthi HD-537. These cryⅠ-cryⅤ linkages showed common characteristics, such as a distance of 0.5-kb between the two genes, the presence of a strong terminator of the cryⅠ gene in the intervening sequence, the absence of promoter structures of cryⅤ genes. But B. thuringiensis subsp. thompsoni HD-542 seemed to contain only a cryⅤ-type gene. We also isolated a novel cryⅤ-type gene from the strain HD-542. Analysis of partial sequences of this cryⅤ-type gene revealed that there are no cryⅠ-type genes upstream of the cryⅤ-type gene.
DNA dot blot hybridization을 이용하여 B. thuringiensis 가 가지고 있는 살충성 유전 자의 분포를 알아보았다. 사용한 probe는 나비목에 특이성이 있는 cryⅠ을 검색할 수 있는 cryⅠ-specific probe 및 나비목과 딱정벌레목에 동시에 살충성을 나타낸다고 하여 새롭게 분류된 cryⅤ유전자를 식별할 수 있는 cryⅤ-specific probe를 사용하였다. 총 24 균주를 조사하였는데 이중 12 균주가 cryⅤ-specific probe에 양성을 나타내었다. 대부분의 cryⅤ-양성 균주들은 cryⅠ-specific probe에 역시 양성반응을 보여서 cryⅤ유전자와 cryⅠ유전자가 밀접하게 연관되어있음을 시사하였다. B.
thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 및 B. thuringiensis subsp. entomocidus BP465균주로부터 cryⅤ-type의 유전자를 분리하였으며 이들의 염기서열을 결정한 결과 총 719 아미노산을 코딩하는 open reading frame을 발견할수 있었다. HD-1에서 분리한 $cryⅤ_1$ 유전자와 BP465에서 분리한 cryⅤ465 유전자를 E. coli에서 발현시킨후에 독성검정을 하였는데 $cryⅤ_1$ 단백질은 누에 및 배추좀나방 유충에 독성을 나타낸 반면 $cryⅤ_465$ 단백질은 배추좀나방 유충에 대해서만 독성을 나타내었다. cryⅤ465유전자의 앞쪽에서 cryⅠD-type의 유전자를 발견하였으며 이러한 형태의 유전자연관을 HD-1 및 B. thuringiensis subsp. tolworthi HD-537에서 각각 cryⅠA(a)-$cryⅤ_1$ 및 cryⅠE-$cryⅤ_1$형태로 크로닝하여서 분석하였다. 이들 유전자들은 모두 공통된 특징을 가지고 있었는데 cryⅠ과 cryⅤ의 사이는 0.5-kb이며 여기에는 cryⅤ유전자를 발현시킬 수 있는 promoter가 없었다. 한편 B. thuringiensis subsp. thompsoni HD-542에서 분리한 cryⅤ-type 의 유전자는 다른 cryⅤ-type의 유전자와는 달리 앞쪽에 cryⅠ-type 유전자를 발견할 수 없었다.
