The amino acid sequences of core and non-structural proteins(NS3, NS4 and NSS) of Hepatitis C virus (HCV) were used for the selection of peptides to be synthesized. For the HCV core protein, the whole regin was tested using ten sequential peptides. The epitopes in HCV non-structural proteins were predicted by the combined analyses of the hydropathicity, acrophilicity, flexibility, and antigenicity parameters.
Peptides corresponding to the selected regions were synthesized by a solid-phase method with automatic peptide synthesizer. The synthesized peptides were purified with preparative reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) with a silicated octadecyl($C_18$) column. The majority of the peptides were isolated as a single peak and analyzed its purity using analytical HPLC. Purified peptides were used as test antigens for ELISA.
Antigenic reactivity was compared between free peptide, peptide-carrier conjugate and streptavidin-biotinylated peptide antigen. The result indicated that free peptide antigens showed the low reactivity on both C22 and NS4-1924 peptide and that peptide-carrier conjugate antigens showed the variation in reactivity depending on the peptides used, whereas the application of stretavidin-biotinylated peptide antigen significantly enhanced the reactivity, not influenced by any kinds of antigenic peptides.
The relative sensitivity of free peptides, peptide-carrier conjugates, or streptavidin-biotinylated peptides antigens was also investigated. The results demonstrate that the streptavidin-biotinylated peptide antigen is the most efficient one for detecting antibodies in HCV-infected sera and setup for peptide-based identification of immunodominant epitopes.
To determine the immunodominant regions of the core and non-structural protein of HCV, thirty-two synthetic peptides were tested for their reactivities against HCV antibody positive sera. Among them, 15 peptides (8 corresponding to the core peptides, 4 corresponding to the NS4 peptides, and 3 corresponding to the NS5 peptides) reacted with the HCV infected sera. In particular, C22(core peptide) and NS4-1924(NS4 peptide) were the most reactive with the serum samples giving a positive signal with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit.
One hundred eighty-nine sera infected with HCV was analyzed to examine the antibody specificity against individual peptide antigen. The characteristic two patterns of antibody specificity to each peptide antigens were noticed. The first was characterized by the presence of the anti-HCV antibody positive exclusively to the core peptides (12.7%) of the tested 189 sera. The second aspect showed HCV antibodies reactive only to NS4 peptide antigen(4.2%). These results indicate that C2, C22, NS4-1719, and NS4-1924 peptide antigens are essential antigens for serological assay system.
Assays were also performed on blood donors and serum samples obtained from 34 Koreans clinically diagnosed as chronic liver disease patients. For the blood donors and chronic liver disease patients, the most common epitopes detected were seven peptides (C2, C22, C75, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, and NS5-2282), which covers 100 % of the HCV antibody positive sera. In addition, our results indicate that there are substantial variations in the profile of the antigens recognized by the immune sera in chronic liver disease samples. Taken together, these results suggest that several epitopes of core and non-structural protein should be used to diagnose the HCV infection because the profile of antibody production during HCV infection is diverse as observed in this study.
Based on above observations, indirect ELISA employing the combination of immunodominant seven peptides (C2, C22, C75, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, and NS5-2282) was compared with commercially available ELISA kits by testing mixed titer performance panel. The results reported here indicate that seven epitopes covering core, NS4 and NS5 protein are sufficient to detect HCV antibodies to these regions and that the selected peptides are useful antigens in detecting antibodies in sera from individuals infected with HCV.
펩타이드 합성을 위한 부위 선별을 위해 C형 간염 바이러스의 핵 및 비구조 단백질 (비구조 3, 비구조 4 및 비구조 5)의 아미노산 서열을 이용하였다. C형 간염 바이러스의 핵 단백질의 경우, 전체 부위를 10 종류의 순차적인 펩타이드를 사용하여 검사하였다. C형 간염 바이러스의 비구조 단백질의 항원 결정기는 친수성, 소수성, 유연성, 크기 및 항원성 변수들을 종합 분석하여 예측하였다.
선별된 부위에 해당하는 펩타이드는 펩타이드 합성기를 이용하여 고체상 방법으로 합성하였다. 각각의 펩타이드의 N-말단 부위에 세린, 글리신, 세린 및 글리신의 4개의 아미노산을 연결고리로서 더해졌다. 바이오틴은 펩타이드 합성이 끝난 후 각 펩타이드의 N-말단 아미노 그룹에 접합되었다. 합성된 펩타이드는 18개의 탄소 길이를 가진 컬럼을 이용하여 대량의 역상 고속 액상 크로마토 그래피를 수행하였다. 펩타이드의 대부분은 단일 피크를 얻어 엘리사를 위한 검사 항원으로 사용되었다.
자유 펩타이드, 펩타이드-담체 접합액 및 스트렙토 애비딘-바이오틴 결합 펩타이드 항원간의 항원 반응성을 비교하였다. 펩타이드-담체 접합은 2-이미노 티올레인 방법을 이용하였다. 실험 결과 자유 펩타이드 항원은 C22 및 NS4-1924 펩타이드 항원 모두 낮은 반응성을 보였으며, 펩타이드-소혈청 알부민 접합 항원은 사용되는 펩타이드 종류에 따라 반응성의 변화를 보였다. 반면에 스트렙토 애비딘-바이오틴 결합 펩타이드 항원은 반응성이 크게 향상됨을 보였으며 펩타이드의 종류에 관계없이 일정한 결과를 보였다.
자유 펩타이드, 펩타이드-담체 접합액 및 스트렙토 애비딘-바이오틴 결합 펩타이드 항원의 상대적인 민감도를 조사하였다. 실험 결과 스트렙토 애비딘-바이오틴 결합 펩타이드 항원이 C형 간염 바이러스에 감염된 혈청에 있는 항체 검출에 가장 효과적인 것으로 나타났으며, 면역우성 결정기의 확인을 위한 항원 방법으로 결정하였다.
C형 간염 바이러스의 핵 및 비구조 단백질에서 선정된 32 종류의 합성 펩타이드의 반응성을 정상인 혈청, C형 간염 바이러스 항체 양성 혈청 및 만성 C형 간염 환자의 혈청 등을 이용하여 각 펩타이드의 반응성을 조사하였다. 32 펩타이드 중에서 15 종류 (8종류는 핵 펩타이드, 4종류는 비구조 4 펩타이드, 3종류는 비구조 5 펩타이드)의 펩타이드가 반응성을 보였다. 이들 펩타이드는 핵 단백질에서는 아미미노산 2-21(C2), 22-41(C22), 42-49(C42), 50-74(C50), 75-99(C75), 100-115(C100), 116-131(C116) 및 143-168(C143)에 해당되며, 비구조 4 단백질에서는 1694-1714(NS4-1694), 1719-1735(NS4-1719) 및 1924-1943(NS4-1924)에 해당된다. 또한 비구조 5 단백질에서는 2282-2305(NS5-2282), 2363-2383(NS5-2363) 및 2469-2491(NS5-2469)에 해당된다. 특히, C22와 NS4-1924 펩타이드는 상업화되어 있는 엘리사 키트로 양성으로 확인된 혈청들의 대부분과 반응성을 보였다.
C형 간염 바이러스에 감염된 189개 혈청에 대해 각각의 펩타이드 항원에 대한 항체 특이성을 조사하였다. 2가지 패턴의 특징적인 항체 특이성이 나타났다. 첫째는 핵 펩타이드에 대한 항체만 나타나는 경우였으며(12.7%), 두번째 패턴은 비구조 4 펩타이드 항원에 대한 항체만 나타나는 경우였다(4.2%). 이들 결과를 통해 C2, C22, NS4-1719 및 NS4-1924 펩타이드 항원은 혈청학적인 분석에 필수적인 항원임을 알았다.
공혈자 및 만성 간염 환자로 진단된 34 명의 혈청을 이용하여 어떤 항원 결정기가 보편적으로 존재하는지 조사한 결과, 7종류의 항원 결정기를 이용하여 C형 간염 바이러스에 감염된 혈청을 100% 검출할 수 있었다. 또한 만성 간염 환자의 경우, 생성되는 항체가 여러 항원에 대해 생성됨을 알 수 있었다. 이들 사실은 C형 간염 바이러스에 감염 기간에 따라 항체 생성 분포가 다양해지기 때문에 C형 간염 바이러스 감염 진단에 핵 및 비구조 단백질의 여러 항원 결정기가 사용되어야 한다는 것을 제시하고 있다.
위의 관찰을 근거로 하여, 7종류의 펩타이드 (C2, C22, C75, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924 및 NS5-2282)을 섞은 항원을 이용한 간접 엘리사 방법을 혼합 역가 수행 판넬을 검체로 하여 상업적으로 구입 가능한 엘리사 키트와 비교하였다. 실험 결과 핵, 비구조 4 및 비구조 5를 포함하는 7종류의 항원 결정기는 이들 단백질에 대한 항체를 검출하는데 충분함을 알 수 있었으며, 이들 펩타이드들은 C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈청에서 항체를 검출하는데 유용한 항원임이 입증되었다.
