Streptomyces griseus trypsin (SGT) is one of the extracellular proteinases, which is produced by S. griseus. Low concentration of SGT in Pronase which was obtained from the culture broth of S. griseus made it difficult to purify SGT in pure form. Therefore the sprT gene which encodes premmature SGT protein was cloned in the plasmid pWHM3, a Streptomyces - E. coli shuttle vector. When the recombinant plasmid was introduced in S. lividans TK24, two proteins with molecular weight of 28 kDa and 42kDa respectively were detedted. The protein with a molecular weight of 28 kDa was a SGT protein and larger protein with a size of 42 kDa was supposed to be a premature form of the SGT protein. The SGT protein was purified to homogeneity in via of many steps of chromatographies, such as CM-sepharose chromatography, Mono-S chromatography and Superose-12 chromatography from the culture of S. lividans TK24 harboring the sprT gene. The SGT proteins from the Pronase and the transformant were compared for their N-terminal amino acid sequence, isoelectric point optimal pH and optimal temperature. All the properties studied above were the same in both SGT. Those results suggested that the sprT gene from S. griseus was successfully expressed in the heterologous host, s. lividans TK24 and the amount of the expressed SGT was reached to 5 times at least when it was calculated by the enzymatic activity against artificial substrate. This approach will be very helpful for the study fo Streptomycete proteases to elucidate its regulatory and processing mechanisms and its three-dimensional structure.
Streptomyces griseus trypsin (SGT)는 S. griseus에서 분비되는 단백질 분해효소중의 하나이다. S. griseus의 배양액에서 얻어내는 Pronase에서는 SGT가 소량으로 존재하여 분리정제시 어려움이 있다. 그래서 SGT를 encoding하는 sprT 유전자를 Streptomyces-E. coli shuttle vector인 pWHM3에 cloning하여 S. lividans TK24에 형질전환하였다. 재조합균주에서 28 kDa와 42 kDa의 크기를 갖는 2개의 단백질이 발현되는 것을 알 수있었는데 전자는 SGT이었고 후자는 아마도 SGT의 전구체라고 추측된다. 재조합 균주의 배양액에서 SGT를 분리하기 위해서 Ammonium sulfate 침전과 CM-sepharose 크로마토그래피, FPLC를 이용한 Mono-S 크로마토그래피와 Superose-12 크로마토그래피로써 순수 분리하였다. Pronase와 재조합균주에서 각각 분리한 SGT의 등전점은 둘다 4.65이하로 강한 산성을 띤 단백질이었고 재조합균주에서 분리한 SGT의 N-말단의 아미노산 서열은 기존에 보고된 Pronase에서 분리한 SGT의 Processing기작이 S. griseus와 마찬가지로 일어나는 것을 알 수있다. SGT는 pH 8.0과 섭씨 50도 에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 위와 같은 결과로 미루어 보아 sprT유전자를 재조합균주에서 처음으로 발현에 성공하였음을 알 수 있었고 발현된 SGT의 양은 S. griseus에 있는 양보다 최소한 5배 이상 되리라 본다. SGT를 대량 발현하는 재조합균주는 앞으로 단백질공학을 이용한 3차 구조연구와 반응기작연구에 매우 유용하리라 본다.
