Development of imaging technology has enabled visualization of biological molecules in cells with high resolution. Diverse fluorescent tags and small molecules have been developed, and small molecule probes have advantages with relatively small size and photostability. In this study, we have detected mitochondrial peroxynitrite with a benzoindocyanine based probe. Peroxynitrite is a strong oxidizing ROS which can damage cellular components, and its overproduction is implicated in detection of various clinical diseases. We expect our probe to be applied in the detection and screening of peroxynitrite in various physiopathological processes.
Expanding genetic code with unnatural amino acids (UAAs) gives new functionalities to proteins. Bio-orthogonal UAAs have been used in biochemical research and protein engineering to provide proximity-enabled protein fusion or site-specific coupling or labeling of fluorescent dyes. Furthermore, recent UAAs have used click-chemistry such as SPAAC and SuFEx that occur orthogonally in biological conditions. We designed and confirmed reactivity of a sulfonyl fluoride specific amino acid, 3-fluoro-4-hydroxybenzoyl-L-lysine (FhbK). We selected evolved Pyrrolysyl-tRNA Synthetase from Methanomethylophilus alvus via Molcular Dynamics study, and FhbK was incorporated into model protein. With its long side chain, incorporated FhbK would have enhanced reactivity with target chemicals. This bio-orthogonal reaction between our novel UAA and chemical dyes having sulfonyl/sulfonate functional groups such as dansyl fluoride, would be particularly useful for imaging and functional studies of proteins in vivo.
이미징 기술의 발달과 함께, 세포 내 생체 분자들을 고해상도로 관찰할 수 있게 되었다. 다양한 형광 단백질 표지와 저분자 형광체들이 개발되고 있으며, 특히 저분자 형광체는 크기가 작고 photostable한 장점이 있다. 본 학위논문에서는 benzoindocyanine 기반의 프로브를 사용하여 미토콘드리아에 존재하는 peroxynitrite를 진단하였다. Peroxynitrite는 강한 산화력을 가진 활성산소로, 과하게 생성될 경우 생체조직을 손상시킬 수 있다. 다양한 질병에서 과잉 생성된 peroxynitrite가 탐지되고 있기 때문에, 향후 이번 연구에서 사용한 프로브를 병리학적 연구에 사용할 수 있을 것이라 생각한다.
천연 아미노산을 이용한 유전 암호 확장은 단백질에 새로운 기능을 부여할 수 있다. 특히, 생물직교성을 갖는 비천연 아미노산은 생화학 연구 및 단백질 공학에서 위치 특이적인 표지 도입 및 단백질 복합체 형성과 같은 다양한 목적으로 활용되고 있다. 또한 최근에는 생리학적 조건에서 직교성을 갖는 SPAAC 및 SuFEx와 같은 클릭 반응기를 갖는 비천연 아미노산 연구가 진행되어왔다. 본 학위논문에서는 플루오르화 설포닐기 특이적으로 반응하는 아미노산을 설계 및 반응성을 검증하였고, 분자동역학 시뮬레이션을 통해 선택한 evolution된 Methanomethylophilus alvus의 아미노아실 tRNA 합성효소를 이용해 모델 단백질에 도입하였다. 단백질에 위치특이적으로 도입된 비천연 아미노산은 긴 곁사슬을 통해 표적 화학물질과 높은 반응성을 가질 것으로 예상된다. 또한 설포닐/설폰산 작용기를 가진 형광 프로브 간의 생체 직교 반응은 생체 내 단백질의 이미징 및 기능 연구에 특히 유용할 것으로 기대된다.
